A local BLAST based high throughput primer designing R package （LightPrimer） and its application

Ya-jun XIONG, Yi-jie CHEN, Juan ZOU, Fan ZHANG

CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2022, Vol. 44 ›› Issue (5) : 1130-1138.

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CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2022, Vol. 44 ›› Issue (5) : 1130-1138. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2021258

A local BLAST based high throughput primer designing R package （LightPrimer） and its application

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HeighLight

The primer quality is one of the important factors affecting PCR reaction. The shortcomings of current primer design software mainly lie in relatively low throughput, complicated operation process and less extent of source opening. In this study, a high-throughput primer designing software （LightPrimer） was developed for cloning, quantitative real time PCR （qRT-PCR）, SNP and InDel markers development based on R and Local-BLAST. LightPrimer extracts specific sequences from the working genome via sequence information, followed by sequence fragmentation, Then basic local alignment between fragmentated sequences and the genome is performed by Local-BLAST, screening of highly specific fragmentated sequences which are filtrated through sequence specificity index and matched loci. After that a list of candidate primers is to be obtained by filtration of Tm, GC content, amplicon length, primer length, 3' end matching, GC end base and dimer screening. The sequence evaluation diagnostic plot could provide a reference for primer optimization if no target primers were obtained. LightPrimer is of high throughput, simple operation process, cross platform and open source, which could be a useful supplement to the existing primer design software. The LightPrimer can be downloaded from gitHub （https://github.com/YangtzeSoyGDB/LightPrimer.git）.

Key words

local BLAST / high throughput / primer designing / R

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Ya-jun XIONG , Yi-jie CHEN , Juan ZOU , Fan ZHANG. A local BLAST based high throughput primer designing R package （LightPrimer） and its application[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2022, 44(5): 1130-1138 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2021258
多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是分子生物学研究的基本技术，受到模板、引物、反应条件等多种因素的影响，其中引物质量的优劣与PCR反应密切相关。常用的PCR引物设计软件，以Primer3软件为代表，大体上可分为网络版软件（Primer3/plus、Primer-Blast、Batch Primer3、PCR-Suite、Oligoarchitect、PrimerX等）[1~3]、单机版软件（Prmer3/plus、FastPCR、SDM-Assist、CloneAssistant 1.0、SP designer、Oligo7、Primer Premier5、Vector NTI Suite、Dnastar、Beacon Designer、BiSearch、PerlPrimer、MethPrimer、GenScript Primer Design等）[4~13]和在线引物数据库搜索引擎（qPrimerDB、PrimerBank）[14,15]，其中以开源在线设计软件为主，单机版软件为辅（附表1详见首页OSID码）。从功能上看，目前主要的引物设计软件以常规为主（克隆引物设计、qRT-PCR引物设计等），兼有其他目的引物设计（如探针设计、甲基化引物设计、定位诱变引物设计等）。从可获得性来看，单机版软件中仅Primer3、Primer3plus和FastPCR为开源软件，其余均为商业版，在线软件以开源为主仅少数为商业版。对单机版软件而言，所有软件均能在Windows操作系统运行，少数开发了MacOS系统版本，仅有Primer3/Primer3plus可同时可在Windows、MacOS和Linux操作系统下使用。Primer3/Primer3plus因同时具有开源的在线和单机版本，且具有跨操作平台的优点，赢得了科研工作者的青睐。
从引物设计流程来看，在线软件多采用了序列（信息）输入（fasta格式序列或从网络数据库中获取序列ID），根据引物设计参数从输入序列中搜索合适的序列片段输出为候选引物序列，同时部分软件结合了网络数据库进行引物序列特异性分析，最终选择符合条件的特异性引物序列（如Primer-Blast）[16]，然而多数软件并未进行序列特异性分析，使用者需要在获得引物候选序列的基础上，然后在特定网站进行序列特异性分析，并最终获得特异性好的引物序列。因此，加强序列特异性的分析板块和提高引物设计软件步骤简洁性是引物设计软件改良的重要方向。
从引物设计软件开发语言来看，绝大多数软件采用了C、C++、Perl、Bioperl、PHP、Java、Javascript和Python等，不论是在线版软件还是单机版软件，均采用了较为友好的界面设计，多数采用WUI（Web-based User Interface），少数采用CUI（Console User Interface）和GUI（Graphical User Interface）[17]。虽然面向对象设计增进了与使用者间的互动，操作复杂，也因此在效率上存在不足。R语言作为跨平台的开源开发工具，在统计和图形方面优势明显，但面向对象设计不如其他语言，当前引物设计软件注重与使用者之间的交互性，因此极少见到基于R语言开发的引物设计软件。
伴随着科技进步，自人类基因组计划完成以来，数以千计的物种完成了基因组测序。据不完全统计，截止2021年8月31日，共有594个植物物种（包括亚种）完成了基因组测序（https://www.plabipd.de/index.ep）。同时，不同研究通过重测序等方式获得了大量同一物种不同个体间的大量变异位点（SNP、InDel等），为遗传分析和分子生物学研究积累了大量基础数据。对于大量的SNP和InDel标记开发，虽然能通过已有引物设计软件完成，但并不高效，亟需开发高通量SNP和InDel标记开发软件。从设计通量的角度，多数引物设计软件每次仅能对单一序列进行分析，仅Primer3/Primer3plus单机版可进行高通量设计[1]，在线软件Batch Primer3能提供小于500条序列的引物设计[2]，而高通量则是多数引物设计软件的短板。
针对当前引物设计软件存在的不足，本研究研发并系统介绍了基于本地BLAST的高通量引物设计软件（LightPrimer），该软件利用本地BLAST对引物序列特异性进行评估，简化了序列的获取过程，优化了引物设计参数的输入和引物设计结果输出，兼顾了常用克隆引物设计和qRT-PCR引物设计，并开发了专门针对SNP和InDel标记引物设计的应用程序。LightPrimer以R语言作为开发语言，兼具有开源和跨平台的特点，期待能为科研工作者提供高效便捷的引物设计工具。

1 LightPrimer包的设计思路及基本功能

LightPrimer（Local_blast-based integrative and graphical high throughput Primer）引物设计软件包括序列提取、输入序列的片段化、片段化序列BLAST比对分析和基于用户选择的片段筛选等四个主要组成部分（图1）。序列提取主要根据用户提交的序列信息从基因组中批量提取序列，片段化采用用户自定义的窗口大小（window size）和步长（stepwise）生成，片段化序列与用户自定义数据库序列（genome）进行本地BLAST比对，生成比对信息列表，然后对列表进行统计分析，计算每一条片段化序列的GC含量、Tm值、序列特异性指数、比对位点数、末端匹配、末端碱基类别及引物二聚体等并进行筛选，最后设计出满足特定需求的候选引物序列，具体算法借鉴了Primer3 [1]。为了更好筛选高序列特异性引物序列，LightPrimer引入序列特异性指数（Sequence specificity index， SSI），其计算方式为：
SSI=∑in(Pi)/n
其中，Pi 为某片段第i个比对位点比对的百分数（Percentage），n为比对位点的总数。多数情况下，比对位点数越多其序列特异性指数SSI越低，但不排除同一序列比对到多个位点但同时每个比对位点均具有较高的比对百分数，因此，序列特异性指数须同时结合比对位点数对比对结果进行筛选，方可甄别高特异性序列片段。
Fig. 1 Schematic diagram of LightPrimer

图1 LightPrimer引物设计流程

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根据序列与注释基因的相互关系及序列的类型，LightPrimer将目标序列分为四类，分别是与基因相关序列（Gene）、与基因无关片段序列（Fragment）、SNP序列和InDel序列。结合实际需求，LightPrimer主要完成三个方面的功能：克隆引物设计、qRT-PCR引物设计和SNP/InDel标记引物设计。其中克隆引物设计主要针对基因和序列片段，qRT-PCR主要针对特定基因mRNA序列，标记引物设计主要针对高通量测序过程中产生的SNP和InDel。

2 LightPrimer软件文件系统、数据格式及参数设计

2.1 文件系统

为便于检索，LightPrimer文件系统分为基础文件、输入文件、序列提取文件、序列评价文件与引物设计文件五类。基础文件夹（./Basic.files/）存储基因组序列（*.genome.fasta/fas/fa）和gff注释文件（*.gff），输入文件夹（./Input.files/）存储不同类别序列输入文件模板及说明文档，序列提取（./Sequence.extraction/）及序列评价文件夹（./Sequence.evaluation/）分别包含Fragment、Gene、SNP、InDel四个文件夹，分别存储提取和评价的生成文件，在其中按照不同的基因、片段、SNP或InDel名称分别构建文件夹存储相应文件。生成的引物文件存储于不同类别引物设计文件夹中（图2）。
Fig. 2 File system of LightPrimer

图2 LightPrimer文件系统

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2.2 基本数据格式

LightPrimer包涉及的数据包括五类，分别为基础数据、输入信息数据、序列提取数据、序列评价数据和引物设计数据，其中前两类为输入数据，后三类均为输出数据，分别储存于工作路径下不同的文件夹里，详见图2。
基础数据包含基因组序列文件和基因组特征文件，分别储存于./Genome/和./gff.file/文件夹中。基因组序列为*.fasta格式文件，系通用格式，可不同染色体分别存储不同文件当中，也可所有染色体合并存储于一个文件当中。基因组特征文件全称Generic Feature Format，描述了基因组上各种特征的区间信息，包括染色体、基因、转录本等，原始GFF格式文件包含9列，分别为seqid、source、type、start、end、score、strand、phase、attributes，在本软件中仅使用其中5列（seqid、type、start、end、和strand），不同作物原始GFF文件可使用本软件中gff.transforming（）函数进行格式转换。
输入文件，包括四类基本序列（Gene、Fragment、SNP和InDel，由seqType参数指定），根据其自身特点设计必须包含信息类别，其中基因序列必须包含Gene.ID、Type和For三列，分别代表基因名称、类别和引物设计目的，片段序列必须包含Fragment.Name、Chr、Start和End四列，分别代表片段名称、染色体、起始位置和终止位置，SNP位点必须包含SNP.Name、Chr和Pos三列，分别代表SNP名称、染色体及位置，InDel位点必须包含InDel.Name、Chr、Start和End四列，分别代表InDel名称、染色体、起始位置及终止位置。其他引物评价及设计参数均可以在输入文件中给出，尤其适用于不同序列具有不同参数类别的情形。具体信息在输入文件夹中Template.Instruction.txt文件做具体说明。
序列提取文件，为根据序列及位点信息从基因组文件当中提取的不同类别序列，为*.fasta格式，存储于./Sequence.extraction/文件夹中。
序列评价文件，为提取序列片段化后与基因组进行本地blast生成的片段序列（*.split.seq.fasta）、比对文件（*.blast.out.csv）、评价文件（*.seq.evaluation.csv）及图形诊断文件（*.plotting.pdf）。
引物设计文件，为用户提供了上下游引物的序列、位置、扩增片段大小等基础信息（*.primers.final.csv），结合图形化展示（*.primer.final.plot.pdf），明确引物与输入序列及位点的相对位置。如未发现合适引物，则提供了基本的信息，为进一步调整参数进行优化设计提供了基础数据（*.primers.passed.filtration.csv和*.all.primers.distribution.plot.pdf）。

2.3 参数设计

在LightPrimer中共设置了四类参数，分为序列提取参数、序列评价参数、引物设计参数及绘图参数四类。序列提取参数包括：database（基因组文件路径，用户输入）、SNPFile（SNP位点文件，用户输入）、InDelFile（InDel位点文件）、geneName（基因名或包含基因信息的文件，用户输入）、lociName（SNP或者InDel位点，用户输入）、fragmentName（片段名称，用户输入）、fragmentFile（片段信息文件，用户输入）、gffFile（gff文件，用户输入）、leftFlanking（目标序列左侧翼序列长度，默认为200 bp）、rightFlanking（目标序列右侧翼序列长度，默认为200 bp）、Strand（序列方向，默认为"+"）、type（序列类型，主要针对基因序列，包括gene、mRNA、CDS、five_prime_UTR和three_prime_UTR）、seqType（序列类别，包含Gene、Fragment、SNP和InDel四大类）。
序列评价参数包括：blastDir（本地BLAST安装路径，用户输入）、Evalue（本地BLAST中e值，默认0.1）、nthreads（本地BLAST使用线程数，默认为2）、windowSize（序列片段化窗口大小，默认为20~25 bp）、stepWise（序列片段化步长，默认为3）、GCScope（GC含量区间，默认为35%~65%）、TmScope（Tm值区间，默认为40℃~65℃）、TmMethod（Tm值计算方法，默认为"both"）、specificityMin（序列特异性最小值，默认为95%）、countMax（比对位点最大值，默认为2，在基因组上不超过2个比对位置）。
引物设计参数包括：primerLength（引物长度，默认为与windowSize一致）、lengthScope（扩增片段长度范围，qRT-PCR引物及标记引物默认扩增片段长度为70bp-150bp，克隆引物无此限制）、endMatch（引物末端匹配，默认为TRUE）、GCend（引物末端是否为"G"或"C"，默认为TRUE）、dimer（是否进行dimer筛选，默认为TRUE）、overlapMin（qRT-PCR引物设计时跨越外显子的最小长度，默认为5 bp）。除此之外，序列评价参数中TmScope、GCScope、specificityMin、countMax参数亦属于引物设计参数类别。
绘图参数包括：segmentLinetype（序列评价诊断图中满足序列特异性及比对数的指示线线型，默认为2，表示虚线）、segmentColor（序列评价诊断图中满足序列特异性及比对数的指示线颜色，默认为"red"）、segmentSize（序列评价诊断图中满足序列特异性及比对数的指示线粗细，默认为0.2）、pointShape1（序列评价诊断图中Tm1值点形状，默认为19，实心圆点）、pointShape2（序列评价诊断图中Tm2值点形状，默认为24，正三角形）、pointSize（序列评价诊断图中GC含量点大小，默认为0.5）、pointSize1（序列评价诊断图中Tm1值点大小，默认为0.5）、pointSize2（序列评价诊断图中Tm2值点大小，默认为0.5）、pointColor1（序列评价诊断图中Tm1值点颜色，默认为"red"）、pointColor2（序列评价诊断图中Tm2值点颜色，默认为"blue"）、hlineType（序列评价诊断图中Tm值阈值线线型，默认为2，虚线）、hlineColor（序列评价诊断图中Tm值阈值线颜色，默认为"blue"）、hlineSize（序列评价诊断图中Tm值阈值线粗细，默认为0.3）、pdfWidth（序列评价诊断图图形宽度，默认值为16）、pdfHeight（序列评价诊断图图形高度，默认值为10）、Fcolor（引物分布图中，Forward引物颜色，默认为"#B2182B"）、Rcolor（引物分布图中，Reverse引物颜色，默认为" #2166AC"）、lcolor（引物分布图中，F与R引物中间连线颜色，默认为"black"）、rectFill（SNP与InDel标记引物分布图，SNP与InDel指示条形颜色，默认为"#FF3300"）
以上参数除序列信息参数（geneName、SNPFile、InDelFile、lociName、fragmentName、fragmentFile）、gff文件（gffFile）、基因组文件（database）、序列类型（seqType）需要手动输入外，其余参数均设置有默认值，如需更改，可直接在命令行或输入文件中赋值给不同参数即可。

3 应用实例及结果

3.1 LightPrimer下载及安装

LightPrimer从github下载（https://github.com/YangtzeSoyGDB/LightPrimer.git）后解压缩，并在RStudio中进行本地安装。并从NCBI（https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/）选择适合本机的本地BLAST版本下载，解压后安装或不安装均可。

3.2 分析步骤

（1）设置工作路径及加载LightPrimer

> setwd（"./"）

> library（LightPrimer）
（2）生成文件系统及输入文件模板

> LightPrimer.preparation（）

运行该命令，可生成如图2所示文件系统，并于./Input.files/文件夹中生成不同序列类型模板文件及模板说明文件。

（3）基础文件及输入文件准备

根据用户研究对象，下载相应物种基因组文件及gff注释文件，分别拷贝到./Basic.files/gff.file/和./Basic.files/Genome/中。Gff注释文件如果并非输入文件格式，可使用如下命令进行格式转换：
> gff.transforming（gffFile = "./Basic.files/gff.file/*.gff"）
同时，根据输入文件模板及说明文件准备输入文件。

（4）引物设计

以qRT-PCR引物设计为例：
> primer.designing.pipeline.for.qRT.PCR（database = "./Basic.files/Genome/", geneName = "Glyma.18G145600", blastDir = "./ncbi-blast-2.12.0+/", gffFile = "./Basic.files/gff.file/Wm82.a2.v1.gene.gff"）
其中，database指定参考基因组序列所在文件夹，gffFile指定基因组注释文件，geneName指定需要进行qRT-PCR引物设计的基因名称（可为文件），blastDir为本地blast软件所在文件夹路径。其余未指定参数采用默认参数值。不同功能类型命令代码示例见首页OSID码，附表2。

3.3 引物设计结果

根据上述程序运行结果可知，Glyma.18G145600基因有两个不同转录本（mRNA），程序分别对两个不同转录本进行序列提取、片段化、评价及引物筛选，通过片段化处理共获得20~25 bp片段6516条，分别与大豆基因组进行本地BLAST比对，共获得14 268条比对记录，其中2647条片段序列在基因组上为单一比对位置，其对应序列特异性指数为100%，其中1692条GC含量在35%~65%之间，1063条Tm值在40℃~65℃之间（图3A-D）。在此基础上，通过引物序列长度、位置（qRT-PCR引物之一须跨外显子）、扩增片段长度、引物末端匹配及GC碱基种类和二聚体筛选，分别获得了44条上游引物和52条下游引物，总有396种组合方式，如图3E所示。此外，示例还对Glyma.18G145600基因克隆引物和SNP标记（SNP.5.26897053）引物进行设计，如图4A、B所示。
Fig. 3 Sequence evaluation plot example of fragmented mRNA sequence of Glyma.18G145600.1（window size: 23 bp, step: 3 bp）
Note: A: GC content, Tm value, sequence specificity, and counts of fragments matched to genome are displayed from top to bottom. Fragments with GC content value between 35% and 65% are indicated by red dashed line; Tm value, blue dashed lines indicate Tm value of 45 and 55 respectively; sequence specificity, fragment with sequence specificity larger than specificityMin （default is 95%） is indicated by red dashed line; counts of locus/loci matched to genome, red dashed lines represent fragments with counts less than countMin （default is 2）; B: Candidate qRT-PCR primer distribution on gene structure, red and blue bar represent Forward and Reverse primer respectively

图3 Glyma.18G145600.1mRNA片段化序列评估示例（窗口大小23 bp, 步长3 bp）

注：A：从上到下依次为GC含量、Tm值、序列特异性和基因组比对位点数。GC含量含量比例在35%~65%之间用红色虚线标示，Tm值图中蓝色虚线分别代表Tm值为40℃和65℃；序列特异性图中红色虚线表示序列特异性值大于specificityMin值，默认为95%，基因组比对位点数分布图中，红色虚线代表比对位置数小于等于countMax参数值，默认为2；（B）qRT-PCR候选引物在基因中的分布，红色为F引物，蓝色为R引物

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Fig. 4 Candidate primer distribution plot of gene cloning and SNP/InDel marker development
Note: A: Candidate primer distribution of Glyma.18G145600 cloning; B: Candidate primer distribution of SNP.5.26897053

图4 克隆引物设计及SNP/InDel标记引物设计图示

注：A：Glyma.18G145600基因克隆引物设计图示；B：SNP.5.26897053-SNP标记引物设计图示

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4 讨论

4.1 LightPrimer保证了引物序列特异性

引物特异性是保证PCR反应效果的核心影响因素之一，通常情况下，研究者在利用网络版和单机版软件进行引物设计之后需要逐一在线进行引物特异性比对，耗时费力。已有常见引物设计软件（附表1，见首页OSID码）中，仅有Primer-Blast整合了在线数据库，可实现在线的引物特异性筛选。本软件优先利用本地BLAST对不同输入序列片段化候选引物进行特异性分析，在符合序列特异性的前提下进行引物设计，有利于提高PCR成功概率。同时，本软件引入序列特异性指数，并结合比对位点数统计，简单高效地完成了序列特异性的筛选，保障了引物设计高特异性。

4.2 LightPrimer实现了引物设计高通量

随着高通量测序的发展和众多标记位点的开发，大规模引物设计越来越成为必要。上述Primer-Blast在线设计程序，虽然保证了引物的特异性，但并不能完成高通量引物设计。目前常见的引物设计软件当中，仅有Primer3/Primer3plus单机版和在线版Batch Primer3能完成高通量（<500序列）的引物设计。引物设计的通量与计算量高度相关，多数在线服务软件因无法提供强大的数据计算能力支撑，而无法提供高通量引物设计服务。由于科研工作者通常仅对单一或少数物种进行研究，且已有PC机性能多数能较好满足本地BLAST需求（生物信息学服务器效果更佳），因此，利用本地BLAST进行高通量引物设计是解决引物设计通量的可行选择。LightPrimer采用根据序列信息或gff格式文件批量提取序列，实现了引物设计的高通量化，满足了批量引物设计需求。

4.3 引物设计软件的跨平台性

跨平台软件对于满足更多的用户需求而言具有重要意义。一般来讲，科技工作者常用的平台系统有Windows和MacOS两种，Linux作为服务器系统语言，使用较少，但通常运行效率较普通PC机更高。常用引物设计软件（附表1）中，仅Primer3和PerlPrimer单机版具有同时可在Windows、MacOS和Linux下运行的不同版本。LightPrimer采用R语言作为开发语言，利用了其优异的跨平台特性，保证了不同平台的通用性。

4.4 LightPrimer的输入及输出特点

Primer3是当前主流的引物设计软件，为很多引物设计软件提供了基础架构参考[17]。在线版和单机界面版软件，为引物设计初学者和仅有少量引物设计需求研究者提供了友好的交互环境。与界面版引物设计软件（Primer3等）相比较，LightPrimer采用了R语言命令行设计，界面不直观，但LightPrimer为用户提供了两种不同的参数输入方式：命令行输入和文件输入。命令行输入针对一个特定的任务，如一条基因/片段序列或一个SNP/InDel标记，其余参数均采用默认值，如果设计结果不如人意，可手动赋值。而文件输入主要针对序列任务而言，只需要提供必要的序列信息即可，可根据具体序列做不同的参数设置，较Primer3单机版更加灵活高效。
对输出文件而言，LightPrimer并未提供如界面版软件那么丰富可调的即视效果，这是本软件的最大短板。为了弥补该不足，LightPrimer提供了输入序列整体的诊断特征图（图3A），为引物的开发提供注脚或提供优化的参考。使用者可根据该图形判断序列整体特征，明确引物序列的可能生成区域，在当前参数设置未获得合适引物序列的情形下进行参数优化设置的参考。同时，筛选得到的引物序列，LightPrimer提供了基因组具体位置图，对基因相关引物设计结果提供了引物序列与基因（侧翼序列、UTR、外显子、内含子等）相对位置图（图3B、图4），简明清晰。另外，LightPrimer输出引物数据为*.csv格式，直接保存到相应文件夹下，方便查阅和下一步引物序列提交。
综上，尽管在引物特异性、高通量、跨平台性等方面，均有不同类型引物设计软件能满足要求，但同时满足以上三个方面需求的引物设计软件少之又少，LightPrimer同时具备高特异性、高通量和跨平台性，是其独特之处。尽管LightPrimer与当前主流软件相比较，具有较多改进，但其仍存在较多不足，如功能较少，仅能完成三种常见引物设计（克隆、qRT-PCR和标记开发）。另外，参数设置与其他界面版软件比较而言还不够细致，整体性能还有待进一步提升。

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