Investigation on the relationship between stem and leaf metabolites and tuber morphology of <i>Cyperus esculentus</i>

Jian-nan MA; Cheng-bin SHAN; Xu FENG; Yue MA; Li-wei WANG; Xiang-qian ZHANG; Xiao-qing ZHAO; Zhan-yuan LU; De-jian ZHANG; Chao-mei MA

doi:10.19802/j.issn.1007-9084.2022208

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CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2024, Vol. 46 ›› Issue (1) : 62-71. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2022208

Investigation on the relationship between stem and leaf metabolites and tuber morphology of Cyperus esculentus

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Abstract

To better utilize the stem and leaf of Cyperus esculentus and facilitate its crop breeding, relationship was studied between phenotypic features and stem-and-leaf metabolites, by investigating phenotypic parameters of 10 cultivars. The parameters including leaf width, tuber width, tuber thickness and tuber height, were compared and analyzed. Stem and leaf metabolites were qualitatively and quantitatively analyzed by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). Results showed that 10 cultivars of C. esculentus were divided into 2 phenotypes, namely wide-leaf round-tuber type and narrow-leaf long-tuber type. Their leaf width was positively correlated with tuber width and tuber thickness. Relative contents of 28 main metabolites were discovered and investigated including flavane-3-ols, caffeic acids and flavonoids. Results showed that the contents of 4 flavonoids (luteolin 7-O-diglucuronide, luteolin 8-C-glucoside, luteolin 7-glucuronide, and luteolin) were significantly higher in wide-leaf round-tuber C. esculentus leaves. Biosynthesis pathways of the 4 differential flavonoids metabolites were deduced and mapped using KEGG and PlantCyc. It was predicted that the wide-leaf round-tuber type was more drought-tolerant than the narrow-leaf long-tuber ones.

Key words

Cyperus esculentus L. / morphology / secondary metabolites / UHPLC-MS/MS

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Jian-nan MA , Cheng-bin SHAN , Xu FENG , Yue MA , Li-wei WANG , Xiang-qian ZHANG , Xiao-qing ZHAO , Zhan-yuan LU , De-jian ZHANG , Chao-mei MA. Investigation on the relationship between stem and leaf metabolites and tuber morphology of Cyperus esculentus[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2024, 46(1): 62-71 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2022208

油莎豆（Cyperus esculentus L. var. sativus Boeck）又名油莎草，为莎草科（Cyperaceae）莎草属一年生草本植物。油莎豆全株包括茎叶、块茎和根须三个部分，其块茎被广泛用于食用油和无麸质食品饮品生产领域^[1,2]。据《新华本草纲要》记载，油莎豆块茎具有一定抗炎作用，并具有行气、健脾胃的功效^[3]。油莎豆原产于古埃及地中海沿岸地区，被认为是仅次于二粒小麦和大麦之后，第三种最古老的驯化粮食作物，享有“生命之果”的美誉^[4]。现已作为一种集粮、油、牧、饲、药及绿化于一体的新型经济作物广泛种植于全球各地，主要包括：欧洲南部、非洲、阿拉伯半岛、南北美洲、澳大利亚和中国等地^[5,6]。现代研究结果表明，油莎豆油的营养价值与橄榄油相似，其品质优于菜籽油，被称为“油料作物之王”，且富含有20余种氨基酸^[7～9]，具有极高的农业种植价值^[10]。国家农业部2016年6月发文《全国种植业结构调整规划（2016—2020年）》，建议在适宜地区示范推广种植油莎豆，以调整种植结构和增加新的食用油来源。截止2021年春季，中国油莎豆种植面积已超10万亩（约6700公顷），产业开发企业达256家，以油莎豆为原料的产品开发多达十余类数十个品种（中国农业产业化龙头企业协会油莎豆产业发展专业委员会统计数据）。农业农村部2021年12月发布《“十四五”全国种植业发展规划》，强调，到2025年，油莎豆作为特色油料作物，种植面积将稳定在20万亩（即1.3万公顷）左右。

然而中国油莎豆产业发展仍面临诸多挑战，由于国内种植的油莎豆多为20世纪60、70年代从国外引进的种质资源，导致其遗传基础不详，种质资源存在严重的混杂与退化^[10]。近年来，从表型特征^[11,12]到转录组测序（RNA-Seq）^[13～15]、随机扩增多态性DNA（RAPD）^[16]、相关序列扩增多态性（SRAP）^[17]等为代表的分子技术手段逐渐用于油莎豆种质资源多样性研究，相关研究结论既凸显了我国现有油莎豆品种的复杂性，也给优质油莎豆品种的选育工作带来了挑战。此外，有关油莎豆地上部茎叶成分的研究鲜有报道，仅敬思群等^[18]报道油莎豆茎叶中黄酮类成分含量较高，且具有较好的体外抗氧化活性，其中黄酮类成分荭草苷具有神经保护作用^[19]。为了更全面地推进油莎豆的栽培育种工作并提升油莎豆整体资源特别是地上茎叶利用率，有必要对油莎豆栽培品种进行表型性状和代谢物关联分析。因此，本研究基于超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术对存在表型差异的不同油莎豆栽培品种进行茎叶代谢物分析，以确定油莎豆块茎形态与茎叶代谢物之间的关联，为油莎豆品种选育、鉴定和茎叶资源利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 植物样本

于2020年9月对种植在内蒙古农牧科学院试验田（40°77'N, 111°67'E）同一土壤条件、播期相同且长势一致的10份油莎豆种质资源进行取样。每种油莎豆随机采挖3株完整植株作为1个生物学重复，重复3次。

1.1.2 化学试剂

甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；甲酸（色谱级，≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

标准品：蔗糖、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、α-亚麻酸、亚油酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸（上海源叶生物科技有限公司）；(+)-没食子儿茶素、(-)-表没食子儿茶素、木犀草素、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-7-二葡萄糖醛酸苷、荭草苷（武汉天植生物技术有限公司）；原花青素B1、儿茶素、绿原酸、隐绿原酸、3-对香豆酰基奎宁酸、5-O-咖啡酰莽草酸（四川省维克奇生物科技有限公司）。

1.1.3 仪器设备

1290-6430型超高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；JP-100S超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；100-QE粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；TB-25电子天平（美国丹佛仪器有限公司）；SC-04离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；移液器（大龙兴创实验仪器（北京）股份公司）；数显卡尺（砀山县通和量具有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 油莎豆特征性表型参数测量

从已采摘的同种油莎豆样本中随机挑选10粒块茎，使用数显卡尺依次测量其宽度（TW，块茎中部最宽处）、厚度（TT，最宽处同圆周的最薄处）和高度（TH，块茎上部至底部最长处）。同时测定相同株系最大叶宽，每份样本10个重复。

1.2.2 供试品和标准溶液制备

供试品：将已采收的油莎豆地上茎叶样本放至于阴凉通风处，干燥至恒重，随后用粉碎机破碎成粉末。称取250 mg粉末加入5 mL 70%甲醇溶液，超声提取（600 W， 40 kHz）10 min/次，共3次。2433 ×g离心5 min，吸上清，过0.22 μm微孔滤膜，转移至进样瓶中，用于UHPLC-MS/MS分析。

标准溶液：分别称取适量标准品，溶解于超纯水或二甲亚砜溶液（DMSO），配置成10 mg/mL的标准储备溶液，吸取上述储备溶液分别加甲醇稀释至10 μg/mL的标准使用溶液，用于UHPLC-MS/MS化合物鉴定分析。

1.2.3 超高效液相色谱-三重四级杆质谱条件

色谱条件：色谱柱：安捷伦ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm）；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱（表1）；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min; 进样量：1 μL。

Table 1 Ultra-high performance liquid chromatography

表1 超高效液相梯度洗脱程序

时间 Time /min	A相 Solvent A /%	B相 Solvent B /%
0.00	99.0	1.0
10.00	80.0	20.0
15.00	65.0	35.0
18.00	0.0	100.0
22.00	0.0	100.0
22.01	99.0	1.0
25.00	99.0	1.0

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI ^- ）；扫描模式（Scan Type）：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；雾化气温度（Gas Temp）：350℃；雾化气流速（Gas Flow）：11 L/min；雾化器压力（Nebulizer）：45 psi；毛细管电压（Capillary，Negative）：3500 V。

1.2.4 代谢物定性与定量

利用三重四级杆（QQQ）质谱中MRM扫描模式，一级质谱扫描确定化合物分子质量数，二级质谱扫描确定特征碎片离子，并通过与标准品或互联网数据库（MassBank、ChemSpider）质谱数据比对，完成代谢物定性分析。通过积分相关代谢物特征离子对质谱峰面积，完成相对定量分析。同时将差异代谢物提交到Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）（https://www.genome.jp/kegg/）和PlantCyc（http://www.plantcyc.org/）网站，进行生物合成通路注释分析。

1.3 数据处理

采用Excel 2020、GraphPad Prism 8和TBtools软件进行数据处理和制图。运用MetaboAnalyst R 包中的OPLSR.Anal函数进行有监督的正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。Agilent MassHunter Data Acquisition软件进行质谱数据采集，Agilent MassHunter Qualitative Analysis软件进行质谱数据分析。

2 结果与分析

2.1 油莎豆表型差异分析

本研究共收集了10份油莎豆种质资源，直观地将其分为2种粒型，即长粒型（6种）和圆粒型（4种）（图1）相关样品信息及表型测定结果如表2所示。对不同粒型油莎豆表型性状分析表明，圆粒叶宽、块茎宽度（TW）、块茎厚度（TT）显著高于长粒；长粒块茎高度（TH）、块茎高宽比（TH/TW）、块茎高厚比（TH/TT）显著高于圆粒；两种粒型块茎宽厚比（TW/TT）无显著差异。通过比较不同块茎表型测定指标，说明叶宽与块茎表型有着重要关联，即叶宽与块茎宽度、块茎厚度呈正相关，与块茎高度、块茎高宽比、块茎高厚比呈负相关。

Fig. 1 Plants and tubers of Cyperus esculentus

Note: A: whole plant; B: enlarged images of the tuber; C: tuber morphology of 10 Cyperus esculentus cultivars; TW: tuber width; TH: tuber height; TT: tuber thickness

图1 油莎豆植株与块茎

注：A：油莎豆全株；B：油莎豆块茎放大图；C：10份供试油莎豆块茎形态

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**Table 2 Phenotypic information of 10 C. esculentus cultivars**

表2 供试10份油莎豆种质资源的表型

资源 Accesion	粒型 Tuber type	叶宽度 Leaf with /mm	块茎宽度 Tuber with （TW） /mm	块茎厚度 Tuber thickness （TT） /mm	块茎高度 Tuber height （TH） /mm	TW/TT	TH/TW	TH/TT
JYD-3	长粒Long	6.1±0.9^c	10.5±1.4^c	9.1±0.9^c	19.5±1.5^ab	1.2±0.1^a	1.9±0.3^a	2.2±0.3^a
JYD-5	长粒Long	6.6±0.5^bc	11.5±1.4^c	9.7±1.2^c	20.6±1.2^a	1.2±0.1^a	1.8±0.2^a	2.2±0.3^a
JYD-7	长粒Long	6.4±0.8^bc	10.8±0.8^c	9.7±1.0^c	16.8±1.3^c	1.1±0.1^a	1.6±0.1^b	1.7±0.2^b
JYD-12	长粒Long	6.1±0.6^c	10.0±1.1^c	8.8±0.7^c	18.2±0.9^bc	1.1±0.1^a	1.8±0.2^a	2.1±0.2^a
JYD-14	长粒Long	6.5±0.6^bc	10.1±1.0^c	9.2±1.0^c	21.1±1.5^a	1.1±0.1^a	2.1±0.2^a	2.3±0.3^a
JYD-20	长粒Long	6.8±0.4^b	11.1±1.0^c	9.2±1.0^c	19.9±1.4^a	1.2±0.1^a	1.8±0.2^a	2.2±0.4^a
平均值 Ave.		6.4±0.3	10.7±0.6	9.3±0.4	19.4±1.6	1.2±0.04	1.8±0.2	2.1±0.3
JYD-6	圆粒 Round	8.7±0.8^a	15.6±1.5^ab	13.0±0.7^a	15.7±0.9^c	1.2±0.1^a	1.0±0.1^c	1.2±0.1^cd
JYD-9	圆粒 Round	8.4±1.1^a	15.9±1.2^a	13.5±1.2^a	15.4±1.2^c	1.2±0.1^a	1.0±0.04^c	1.1±0.1^d
JYD-10	圆粒 Round	8.3±1.0^a	15.4±1.1^ab	13.4±0.9^a	16.4±1.1^c	1.2±0.1^a	1.1±0.1^c	1.2±0.1^cd
JYD-17	圆粒 Round	9.3±0.6^a	14.2±0.7^b	12.0±0.9^b	16.1±0.9^c	1.2±0.2^a	1.1±0.1^c	1.3±0.1^c
平均值Ave.		8.7±0.5	15.3±0.7	13.0±0.7	15.9±0.4	1.2±0.02	1.0±0.04	1.2±0.04

	注：所有数值为平均值 ± 标准偏差（n=10），同列数据后不同字母表示差异极显著（n=10, P<0.01）
	Note: Data were shown as mean ± S.D, n=10. Data followed different letters indicate significant difference at 0.01 level

2.2 油莎豆茎叶主要代谢物鉴定

利用UHPLC-QQQ-MS/MS的MRM扫描模式，从油莎豆地上茎叶共计鉴定主要代谢物28个（表3），其中通过与标准品比对保留时间、母离子和特征碎片离子等信息指认了23个代谢物，包括葡萄糖（1）、奎宁酸（2）、苹果酸（3）、柠檬酸（4）、L-苯丙氨酸（6）、(+)-没食子儿茶素（7）、L-色氨酸（10）、原花青素B1（11）、儿茶素（12）、(-)-表没食子儿茶素（13）、绿原酸（15）、隐绿原酸（16）、顺式-5-咖啡酰奎宁酸（17）、3-对香豆酰基奎宁酸（18）、B型原花青素二聚体（19）、5-O-咖啡酰莽草酸（20）、对香豆酰基奎宁酸异构体（21）、木犀草素-7-二葡萄糖醛酸苷（22）、荭草苷（23）、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷（24）、木犀草素（25）、α-亚麻酸（27）和亚油酸（28）。此外，通过与MassBank和ChemSpider质谱数据库及相关参考文献比对质谱数据信息，初步推断了其余5个代谢物，分别为咖啡酰葡糖二酸异构体1（5）和异构体2（9）^[20]、(表)儿茶素-(表)没食子儿茶素（8）^[21]、(表)阿夫儿茶素-(表)儿茶素（14）^[22]和FA 18:2+3O^[23]。图2分别展示了长粒油莎豆（JYD-3）和圆粒油莎豆（JYD-6）地上茎叶中28个主要代谢物的MRM色谱图，图中所标色谱峰号与表3中化合物编号相对应。

**Table 3 Parent and product ions used for quantification of the major metabolites in C. esculentus leaves**

表3 油莎豆地上茎叶主要二次代谢物定量所用母离子和子离子

峰号 No.	保留时间 t_R /min	质荷比 Parent ion /（m/z）	特征碎片离子对 Product ion-pairs ^a /（m/z）	成分 Compound^b
1	0.53	377.1	341.0， 215.0	葡萄糖 Sucrose*
2	0.53	191.1	85.1， 93.1	奎宁酸 Quinic acid*
3	0.58	133.1	115.1， 71.1	苹果酸 Malic acid*
4	0.98	191.1	111.0， 87.0	柠檬酸 Citric acid*
5	2.22	371.1	209.0， 191.0	咖啡酰葡糖二酸异构体1 Caffeoylglucaric acid isomer 1
6	2.67	164.0	147.0， 103.0	L-苯丙氨酸 L-Phenylalanine*
7	4.04	305.1	125.1， 219.1	（+）-没食子儿茶素（+）-Gallocatechin*
8	4.66	593.1	304.9， 422.8	（表）儿茶素-（表）没食子儿茶素（Epi）catechin-（epi）gallocatechin
9	5.06	371.1	209.0， 191.0	咖啡酰葡糖二酸异构体2 Caffeoylglucaric acid isomer 2
10	5.02	203.0	116.0， 74.0	L-色氨酸 L-Tryptophan*
11	6.79	577.1	289.0， 407.0	原花青素B1 Procyanidin B1*
12	7.41	289.1	245.1， 203.1	儿茶素 Catechin*
13	7.59	305.1	125.1， 219.1	（-）-表没食子儿茶素（-）-Epigallocatechin*
14	8.40	561.1	289.0， 435.0	（表）阿夫儿茶素-（表）儿茶素（Epi）afzelechin–（epi）catechin
15	8.43	353.1	191.1	绿原酸 Chlorogenic acid*
16	9.19	353.1	173.0， 179.0	隐绿原酸 Cryptochlorogenic acid*
17	10.54	353.1	191.1	顺式-5-咖啡酰奎宁酸 cis-5-Caffeoylquinic acid*
18	10.73	337.2	191.2， 173.1	3-对香豆酰基奎宁酸 3-p-Coumaroylquinic acid*
19	11.19	577.1	289.1， 407.0	B型原花青素二聚体 Procyanidin B isomer*
20	11.87	335.2	179.1， 135.1	5-O-咖啡酰莽草酸 5-O-Caffeoylshikimic acid*
21	12.63	337.2	191.2， 173.1	对香豆酰基奎宁酸异构体 p-Coumaroylquinic acid isomer*
22	14.02	637.0	351.0， 285.0	木犀草素-7-二葡萄糖醛酸苷 Luteolin 7-O-diglucuronide*
23	14.24	447.1	327.0， 357.0	荭草苷 Luteolin 8-C-glucoside*
24	15.75	461.0	285.0	木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷 Luteolin 7-glucuronide*
25	17.35	285.1	133.1， 151.1	木犀草素 Luteolin*
26	17.80	327.3	211.2， 229.2	FA 18：2+3O
27	19.07	277.3	/	α-亚麻酸 α-Linolenic acid*
28	19.18	279.3	/	亚油酸 Linoleic acid*

	注：峰号见图2；a: 丰度最强的子离子以粗体表示；b: *标注化合物为通过标准品比对鉴定
	Note: Numbers in the first column see to Fig. 2; a: The most abundant product ions are shown in bold; b: Compounds identified with standards are marked with *

**Fig. 2 Multiple reaction monitoring chromatograms of the major metabolites in C. esculentus leaves with different tuber morphology (long-tuber JYD-3 and round-tuber JYD-6)**

图2 不同粒型（长粒JYD-3、圆粒JYD-6）油莎豆茎叶代谢物MRM色谱图

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2.3 油莎豆茎叶主要代谢物相对含量差异分析

2.3.1 主要代谢物相对含量测定

为了比较分析不同表型油莎豆地上茎叶中主要代谢物的含量差异，本研究选取MRM模式下代谢物特征碎片离子中丰度最强的子离子作为定量离子，丰度其次的子离子作为定性离子，并通过积分定量离子色谱峰面积绘制聚类热图（图3），比较同一代谢物在不同表型油莎豆地上茎叶中相对含量的高低，图3中红色和蓝色分别表示代谢物含量的高和低。

**Fig. 3 Heatmap analysis of major metabolites in C. esculentus leaves with different tuber morphology**

图3 不同粒型油莎豆茎叶主要代谢物相对含量聚类热图

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2.3.2 差异代谢物筛选

依据正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型进一步对差异代谢物进行分析，所构建模型R²X= 0.72，R²Y= 0.968，Q²= 0.857，表明模型可靠，结果如图4A所示，长粒型油莎豆和圆粒型油莎豆被独立分成两组，分别位于置信区间的左侧和右侧，表明两组样本区分效果明显，组间存在较大的代谢差异。依据OPLS-DA模型的变量重要性投影（variable importance in projection, VIP）和代谢物相对含量差异倍数值（fold change, FC）筛选差异代谢物，其中FC≥2或FC≤0.5，且VIP≥1的代谢物被认定为差异代谢物。从28个主要代谢产物中最终确认4个差异代谢物，分别为木犀草素-7-二葡萄糖醛酸苷（luteolin 7-O-diglucuronide，22）、荭草苷（luteolin 8-C-glucoside，23）、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷（luteolin 7-glucuronide，24）和木犀草素（luteolin，25）。通过绘制差异代谢物相对含量柱状图（图4B），结果表明上述4个黄酮类化合物在宽叶圆粒型油莎豆茎叶中的含量显著高于窄叶长粒型油莎豆茎叶，特别是荭草苷和木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷含量相对较高，可作为油莎豆地上茎叶代谢物鉴别地下块茎表型差异的关键标志代谢物。

**Fig. 4 Score scatter plot (A) for OPLS-DA and peak areas (B) of 4 differential flavonoid metabolites identified in C. esculentus leaves with different tuber morphology (n=3)**

图4 OPLS-DA得分图（A）及不同粒型油莎豆茎叶中4个黄酮类差异代谢物相对含量柱状图（B）（n=3）

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2.3.3 黄酮类差异代谢物合成通路推导

利用KEGG^[24]和PlantCyc^[25]数据库，结合植物体黄酮类化合物的生物合成途径^[26,27]和本研究从油莎豆茎叶中鉴定的4个黄酮代谢物，推导了不同粒型油莎豆茎叶中木犀草素-7-二葡萄糖醛酸苷、荭草苷、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷和木犀草素4个黄酮类差异代谢物生物合成途径（图5）。苯丙氨酸（L-phenylalanine）是莽草酸途径的初始产物，经苯基丙酸途径生成柚皮素查尔酮（naringenin chalcone），经查尔酮异构酶（CHI）的作用缩合生成柚皮素（naringenin）。柚皮素是黄酮类化合物合成过程中大多数中间代谢物和最终产物的共同前体，这也导致了黄酮类化合物的结构相似性。在类黄酮3′-羟化酶（F3′H）的作用下，柚皮素合成圣草酚（eriodictyol）后进入油莎豆茎叶4个黄酮类代谢物合成的两个途径。途径一^[28]：圣草酚经黄酮合酶1（FNSⅠ）或黄酮合酶2（FNSⅡ）催化生成木犀草素（luteolin，25），25与二磷酸尿苷葡萄糖醛酸（UDP-葡萄糖醛酸）经木犀草素 7-O-葡萄糖醛酸基转移酶（LGT）催化合成木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷（luteolin 7-glucuronide，24），后24进一步与UDP-葡萄糖醛酸经木犀草素7-O-葡萄糖醛酸苷2′′-O-葡萄糖醛酸基转移酶（LMT）催化生成木犀草素-7-二葡萄糖醛酸苷（luteolin 7-O-diglucuronide，22）。途径二^[29,30]：圣草酚经类黄酮2-羟化酶催化生成2-羟基圣草酚（2-hydroxyeriodictyol），后无需酶催化形成开环形式（动态平衡）并与UDP-葡萄糖醛酸经C-糖基转移酶（CGT）和脱水酶（DHT）催化最终生成荭草苷（luteolin 8-C-glucoside，23）。结合代谢物相对含量分析结果，宽叶圆粒型油莎豆茎叶中4个黄酮类代谢物表达量均上调（图5红色↑R），反之窄叶长粒型油莎豆茎叶中黄酮类代谢物表达量均下调（图5绿色↓L），特别是荭草苷（luteolin 8-C-glucoside，23）和木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷（luteolin 7-glucuronide，24）（图5黄色背景化合物）在不同粒型油莎豆茎叶中表达量差异最为显著。

**Fig. 5 Deduced biosynthesis pathways of 4 differential flavonoids metabolites (blue/red structure) identified in C. esculentus leaves with different tuber morphology**

Note: PAL: phenylalanine ammonium lyase; C4H: cinnamic acid 4-hydroxylase; 4CL: 4-coumarate-CoA ligase; CoA: acetyl coenzyme A; CHS: chalcone synthase; CHI: chalcone isomerase; F3′H: flavonoid-3′-hydroxylase; F2H: flavanone-2-hydroxylase; UDP: Uridine 5ʹ-diphosphate; FNSⅠ/Ⅱ: flavone synthase 1 or 2; LGT: luteolin 7-O-glucuronosyltransferase; LMT: luteolin-7-O-glucuronide 2′′-O-glucuronosyltransferase; CGT: C-glycosyltransferase; DHT: dehydratase. Red ↑ R: Up-regulation of flavonoids metabolites identified in C. esculentus leaves with round tuber; Green ↓ L: Down-regulation of flavonoids metabolites identified in C. esculentus leaves with long tuber

图5 推导不同粒型油莎豆茎叶中4个黄酮类差异代谢物（蓝/红色结构）合成途径

注：PAL：苯丙氨酸解氨酶；C4H：肉桂酸 4-羟化酶；4CL：4-羟基肉桂酰基CoA连接酶；CoA：乙酰辅酶A；CHS：查尔酮合酶；CHI：查尔酮异构酶；F3′H：类黄酮3′-羟化酶；F2H:类黄酮2-羟化酶；FNSⅠ/Ⅱ：黄酮合酶 1或2；UDP：5′-尿苷二磷酸；LGT：木犀草素 7-O-葡萄糖醛酸基转移酶；LMT：木犀草素 7-O-葡萄糖醛酸苷 2′′-O-葡萄糖醛酸基转移酶；CGT：C-糖基转移酶；DHT：脱水酶。红色↑R：宽叶圆粒型油莎豆茎叶中黄酮类代谢物表达量上调；绿色↓L：窄叶长粒型油莎豆茎叶中黄酮类代谢物表达量下调

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3 讨论与结论

姜华武^[11]和马紫薇^[12]等人分别对油莎豆表型生物学特性进行了研究，结果表明不同地理来源的油莎豆种质具有较高的遗传多样性，不同类型油莎豆在块茎含油量、叶片和植株形态、分蘖特性等方面具有很大差异，其中块茎长宽比、百粒重、块茎产量、叶长宽比、分蘖数、草产量等特性可作为油莎豆种质资源综合评价和表型鉴定的重要指标，相关性分析结果表明，油莎豆叶片形态与块茎高宽比相关性显著。本研究收集的10份油莎豆种质资源依据其表型参数可分为两种，即宽叶圆粒型和窄叶长粒型，油莎豆叶宽与块茎宽度、块茎厚度呈正相关，与块茎高度呈负相关，该实验结果与姜华武和马紫薇等人研究结论一致。毛琳萍^[31]等人利用SSR（simple sequence repeat，简单重复序列）分子标记构建了42份不同地理来源的油莎豆种质资源指纹图谱，结果表明42份油莎豆资源遗传多样性较为丰富，群体杂合度高，利用12对SSR分子标记划分成3个群体，即pop1、pop2和pop3，其中pop1和pop2亲缘关系较近，群体分化与地域分布无关，本研究所选样本来自上述42份油莎豆种质资源中的10份，其中除JYD-14来自于pop1，其余均来自于pop2。

近年来基于质谱技术的代谢组学方法已广泛应用于植物学^[32]特别是农作物^[33]的研究中，Yang^[34]等人利用UHPLC-MS/MS的代谢组学方法探究了40种苦荞谷粒和谷壳的形态差异与代谢产物之间的关系，其研究结果表明苦荞种子中黄酮和蒽醌类代谢产物与种子的颜色和形状之间具有相关性。本研究利用MRM模式UHPLC-QQQ-MS/MS方法快速分析不同块茎表型油莎豆种质资源茎叶中28种主要代谢物，差异代谢物分析结果显示，宽叶圆粒油莎豆茎叶中荭草苷、木犀草素-7-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-7-二葡萄糖醛酸苷和木犀草素4种黄酮类化合物含量显著高于窄叶长粒型油莎豆，或可作为油莎豆地上茎叶代谢物鉴别地下块茎表型差异的标志代谢物。已有研究报道，糖基化黄酮类代谢物的积累有助于植物在生长周期内应对非生物或生物胁迫^[35]。以干旱胁迫为例，Xu^[36]等人研究了干旱胁迫下UDP-葡糖基转移酶调控青稞黄酮合成途径中黄酮苷类化合物的表达，其中就包括木犀草素-C/O-糖苷的积累。Dong^[37]等人研究了干旱胁迫下UDP-葡糖基转移酶调控水稻代谢物的表达，结果表明黄酮合成途径中的关键酶（CHS、CHI和F3′H）以及包括木犀草素-C/O-糖苷等黄酮糖苷类代谢物均表现为显著上调；此外，大粒型水稻相较于小粒型水稻黄酮苷类化合物含量更高。因此本研究推导的4种黄酮差异代谢物生物合成途径，可为后续筛选不同表型油莎豆合成黄酮类代谢物的候选基因及通路关键酶提供研究依据，并且推测，宽叶圆粒型油莎豆相较于窄叶长粒型油莎豆具有更好的耐旱性。本研究结果可为油莎豆的品种鉴定、选育和茎叶资源的利用提供依据，同时也将为更广泛的植物表型与代谢物的关联研究提供参考。

References

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Key words
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1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 植物样本
1.1.2 化学试剂
1.1.3 仪器设备
1.2 方法
1.2.1 油莎豆特征性表型参数测量
1.2.2 供试品和标准溶液制备
1.2.3 超高效液相色谱-三重四级杆质谱条件
Table 1 Ultra-high performance liquid chromatography
1.2.4 代谢物定性与定量
1.3 数据处理
2 结果与分析
2.1 油莎豆表型差异分析
Fig. 1 Plants and tubers of Cyperus esculentus
Table 2 Phenotypic information of 10 C. esculentus cultivars
2.2 油莎豆茎叶主要代谢物鉴定
Table 3 Parent and product ions used for quantification of the major metabolites in C. esculentus leaves
Fig. 2 Multiple reaction monitoring chromatograms of the major metabolites in C. esculentus leaves with different tuber morphology (long-tuber JYD-3 and round-tuber JYD-6)
2.3 油莎豆茎叶主要代谢物相对含量差异分析
2.3.1 主要代谢物相对含量测定
Fig. 3 Heatmap analysis of major metabolites in C. esculentus leaves with different tuber morphology
2.3.2 差异代谢物筛选
Fig. 4 Score scatter plot (A) for OPLS-DA and peak areas (B) of 4 differential flavonoid metabolites identified in C. esculentus leaves with different tuber morphology (n=3)
2.3.3 黄酮类差异代谢物合成通路推导
Fig. 5 Deduced biosynthesis pathways of 4 differential flavonoids metabolites (blue/red structure) identified in C. esculentus leaves with different tuber morphology
3 讨论与结论
References

Received	Published
2022-07-26	2024-02-25
Issue Date
2024-03-05

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1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 植物样本

1.1.2 化学试剂

1.1.3 仪器设备

1.2 方法

1.2.1 油莎豆特征性表型参数测量

1.2.2 供试品和标准溶液制备

1.2.3 超高效液相色谱-三重四级杆质谱条件

Table 1 Ultra-high performance liquid chromatography

1.2.4 代谢物定性与定量

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 油莎豆表型差异分析

Fig. 1 Plants and tubers of Cyperus esculentus

Table 2 Phenotypic information of 10 C. esculentus cultivars

2.2 油莎豆茎叶主要代谢物鉴定

Table 3 Parent and product ions used for quantification of the major metabolites in C. esculentus leaves

Fig. 2 Multiple reaction monitoring chromatograms of the major metabolites in C. esculentus leaves with different tuber morphology (long-tuber JYD-3 and round-tuber JYD-6)

2.3 油莎豆茎叶主要代谢物相对含量差异分析

2.3.1 主要代谢物相对含量测定

Fig. 3 Heatmap analysis of major metabolites in C. esculentus leaves with different tuber morphology

2.3.2 差异代谢物筛选

Fig. 4 Score scatter plot (A) for OPLS-DA and peak areas (B) of 4 differential flavonoid metabolites identified in C. esculentus leaves with different tuber morphology (n=3)

2.3.3 黄酮类差异代谢物合成通路推导

Fig. 5 Deduced biosynthesis pathways of 4 differential flavonoids metabolites (blue/red structure) identified in C. esculentus leaves with different tuber morphology

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**Fig. 2 Multiple reaction monitoring chromatograms of the major metabolites in C. esculentus leaves with different tuber morphology (long-tuber JYD-3 and round-tuber JYD-6)**

**Fig. 3 Heatmap analysis of major metabolites in C. esculentus leaves with different tuber morphology**

**Fig. 4 Score scatter plot (A) for OPLS-DA and peak areas (B) of 4 differential flavonoid metabolites identified in C. esculentus leaves with different tuber morphology (n=3)**

**Fig. 5 Deduced biosynthesis pathways of 4 differential flavonoids metabolites (blue/red structure) identified in C. esculentus leaves with different tuber morphology**