Low-temperature stress caused phenotypic variation in germination and RNA-seq analysis for rapeseed （Brassica napus L.）

Jia-yu SONG, Gen-shui JIANG, Yu-tiao CHEN, Jian-yi ZHAO, Xiao-fu HONG

CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2023, Vol. 45 ›› Issue (6) : 1217-1226.

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CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2023, Vol. 45 ›› Issue (6) : 1217-1226. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2022224

Low-temperature stress caused phenotypic variation in germination and RNA-seq analysis for rapeseed （Brassica napus L.）

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Abstract

For high efficient of rapeseed production by planting late-sowing cultivars in the lower reaches of the Yangtze River, material screening and mechanism of cold tolerance were carried out using 6 approved hybrid varieties and 6 temperature treatments were set. Seed germination characteristics and physiological indicators were studied under low temperature. RNA-seq technology was used for exploring germination differences under low temperature. Results showed that germination rate decreased under low temperature. Varieties Yueyou 1301 and Yueyou 1510 showed obvious advantages with respect to late sowing at low temperatures （<10℃）. SOD activity were consistent with low temperature germination phenotype. Thus we identified 920 differentially-expressed genes （DGEs） that were involved in low temperature germination between Yueyou 1301 and Fengyou 737. Of these, 21 DEGs were related to abscisic acid pathway and starch-sucrose metabolism pathway. In summary, Yueyou 1301 had strong low temperature germination ability. The difference in seed germination ability at low temperature might be caused by hormone signal transduction, activation of reactive oxygen species scavenging systems, and carbohydrate metabolism homeostasis, which might explain the strong cold tolerance of Yueyou 1301.

Key words

Brassica napus L. / low temperature stress / seed germination / late sowing / RNA-seq

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Jia-yu SONG , Gen-shui JIANG , Yu-tiao CHEN , Jian-yi ZHAO , Xiao-fu HONG. Low-temperature stress caused phenotypic variation in germination and RNA-seq analysis for rapeseed （Brassica napus L.）[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2023, 45(6): 1217-1226 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2022224
油菜（Brassica napus L.）是我国主要油料作物之一，约占植物食用油的47%[1]。我国油菜约80%种植于长江流域，为越冬型作物[2]。近年来随着社会经济的发展、农村劳动力的减少和土地流转比例的提高，农业种植制度发生改变，油菜种植模式也随之变化，传统的育苗移栽被免耕直播、无人机飞播，同步旋耕开沟、施肥播种覆土一体等一系列轻简化技术替代[3]，以浙江为例，随着油菜-单季稻种植面积的扩大，以及油菜前茬水稻品种生育期的延长，迫使油菜播种期延后，这就要求品种具有强抗寒耐迟播和春发快长的特性。长江流域大部分地区，油菜接茬水稻收后播种，一般在11月中下旬，气温通常已降至15℃甚至10℃以下，因而常常出现迟直播油菜出苗率低，小苗钝长、冻死的现象[4]。据研究报导油菜适宜萌发温度为15℃以上，当温度低于10℃时，油菜种子萌发率显著降低，幼苗生长受阻，直接影响油菜群体构建和产量形成[5]。因此，在迟播条件下油菜品种应具有强抗寒耐迟播和春发快长的特性。目前急需保障粮油作物种植面积，发展长江流域油菜生产，确保农田绿色过冬，因此探索油菜作物的抗寒机制，选育和推广适合耐迟播的新品种至关重要，对扩增长江流域油菜种植面积具有深远意义。
低温萌发能力受遗传和环境因素共同作用[6,7]。研究表明，低温胁迫下植物体内活性氧（ROS）不断积累，导致胚根突破种皮萌发受阻[8]，为了减轻胁迫下ROS过度积累所造成的损害，植物进化出了复杂的抗氧化防御系统，包括抗氧化酶，如过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）、非酶抗氧化剂，如谷胱甘肽（GSH）和还原型抗坏血酸（AsA），这些物质在维持细胞内ROS的动态平衡上发挥重要作用[9]。在分子水平上，已经阐明了水稻和拟南芥等模式植物低温反应的关键调控网络，包括依赖ABA途径的双重负调控系统PYR/PYL/RCAR┤PP2C┤ SnRK2-ABF/AREB和非依赖ABA的ICE–CBF–COR的信号转导途径[10]。一些关键耐冷基因也已被克隆，包括水稻中的COLD1 [11]、OsCNGC9 [12]、拟南芥中的14-3-3 [13]、油菜中的BnPHR1 [14]。近年来，随着测序技术的发展，利用转录组、蛋白组等功能基因组学分析了油菜低温下的调控机制，低温下种子萌发速率主要受到水通道蛋白NIP5和晚期胚胎发生丰富蛋白基因对水分吸收和运输的调控作用[15]。欧洲油菜系2016TS（G）10苗期低温RNA-seq显示，表达量上调的差异基因多数集中于植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢途径，且AP2/ERF、WRKY和MYB家族中转录因子发生显著变化[16]。除此之外，也发现一些外源物质可以增强油菜种子在低温下的萌发能力，如24-表油菜素内酯[17]、硅酸钠与γ-氨基丁酸[18]、H2O2 [19]、ATP[20]等等。植物抗逆机制十分复杂，油菜耐寒性研究仍处于初级阶段，因此，筛选抗寒性强的油菜品种并分析其作用机制是解决油菜低温萌发率低的有效方法。
对种子低温萌发能力进行遗传改良实现低温下快速萌发和均匀出苗，是油菜在低温胁迫环境中稳产高产的关键。近年来，应用分子育种技术选育的越优系列杂交油菜新品种如沣油737[21]、越优1301[22]、越优1203[23]等在生产中表现出较好的抗寒耐迟播特点，但对其在低温下的萌发能力评价和鉴定，及其耐冷机制尚未见报道。本研究选用6个已经审定或登记的油菜品种，在不同温度梯度下对萌发速率和相对萌发率进行鉴定，明确不同基因型油菜低温萌发特性和萌发临界温度；测定低温下种子抗氧化酶和非酶抗氧化剂变化；利用RNA-seq技术，对比不同耐寒性品种在低温条件下种子萌发的转录调控差异，进一步分析低温萌发差异的原因。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

供试材料见表1。每份材料选取饱满一致的油菜种子，用蒸馏水清洗3遍，播种于铺有双层湿润滤纸的培养皿中，每盘播50粒。将播种后的种子放置于培养箱内培养（黑暗），试验设置25℃、20℃、15℃、10℃、7.5℃、5℃共6个温度处理，每个品种各处理设3次重复，于处理后第3 d、5 d、8 d、10 d、12 d分别统计萌发数。萌发率（%）= 萌发数 / 50 × 100，以25℃为温度对照，计算不同温度下各个材料的相对萌发率，相对萌发率= 不同温度萌发率 / 25℃萌发率 × 100%。
Table 1 Detailed on tested materials

表1 供试材料清单

品种名称

Variety

父母本

Parents

登记号

License number

来源

Source

越优1203

Yueyou 1203

 MSL72A × SHAO1203 GPD油菜（2017）330098

绍兴舜达种业有限公司

Shaoxing Shunda Seed Industry Co.， Ltd.

越优1301

Yueyou 1301

 MSL72A × SX11003 GPD油菜（2017）330154

江山市郎峰种子有限公司

Jiangshan Langfeng Seed Industry Co.， Ltd.

越优1510

Yueyou 1510

 MSL72A × S151031 GPD油菜（2020）330257

金华市三才种业公司

Jinhua Sancai Seeds Industry Company

越优花叶15

Yueyou huaye 15

花叶A × SHAO1203

Huaye A × SHAO1203

 GPD油菜（2022）330048

浙江省农业科学院

Zhejiang Academy of Agricultural Sciences

沣油737

Fengyou 737

湘5A × 6150R

Xiang 5A × 6150R

 GPD油菜（2017）430090

陕西荣华农业科技有限公司

Shaanxi Ronghua Agricultural Technology Co.， Ltd.

浙油51

Zheyou 51

沪油15/浙双6号

Huyou 15 × Zheshuang 5

 浙审油2009001

浙江勿忘农种业股份有限公司

Zhejiang Wuwangnong Seed Shareholding Co.， Ltd.

1.2 生理指标测定

测定超氧化物歧化酶（SOD）酶活性、过氧化氢酶（CAT）活性、谷胱甘肽（GSH）和还原型抗坏血酸（AsA）含量。取25℃萌发第3 d，7.5℃萌发第8 d种子，将培养皿中全部样品（50粒）分别放于2 mL Eppendorf管中，-80℃保存备用。以25℃为对照，计算SOD、CAT、GSH和AsA相对值，生理指标相对增长率=（不同温度生理指标值-25℃生理指标值）/25℃生理指标值×100%。利用酶联免疫分析试剂盒（江苏酶免实业有限公司）完成上述生理指标的测定，利用酶标分析仪（Rayto RT-6100），以空白孔调零，波长450 nm依序测量各孔吸光度（OD值）。

1.3 RNA-seq

采用TRIzol试剂法提取基因组总RNA，NanoPhotometer spectrophotometer和Qubit2.0 Fluorometer检测RNA浓度，经琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA完整性，去除rRNA和mRNA富集，将mRNA片段化后反转录形成双链cDNA，筛选200 bp左右的cDNA进行PCR扩增并构建cDNA文库，最终在IlluminaNovaseq测序平台上对文库进行测序，测序工作由广州基迪奥生物科技有限公司（Genedenovo Biotechnology Co., Ltd.）合作完成。

1.4 测序结果的统计和功能注释

测序结果用fast软件[24]处理，获得高质量的clean reads后，利用bowtie2[25]比对到甘蓝型油菜参考基因组上（ncbi_GCF_000686985.2）。以FPKM值计算基因的表达水平，基于表达量信息，利用R（http://www.r-project.org/）进行主成分分析（PCA）和基因的表达差异分析，筛选FDR< 0.001且|log2FC|≥ 4的基因为显著差异基因（DEG）。利用生物信息平台（https://www.omicshare. com/tools/home/soft/getsoft.html）绘制韦恩，利用差异基因向GO数据库（http://www.geneontology.org/）的各term映射，并计算每个term的差异基因数，获得差异基因中显著富集的GO条目。KEGG分析是由Pathway显著性富集确定差异基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径构成。通路图绘制参考KEGG网络调控图（https://www.kegg.jp/）。

1.5 qRT-PCR 验证

利用Primer5.0设计引物。用RNA试剂盒（DR0408050，浙江易思得生物技术有限公司）提取基因组RNA，反转录试剂盒（PR0402002，浙江易思得生物技术有限公司）反转为cDNA，利用SYBR qPCR荧光定量PCR试剂盒（RR420，TaKaRa）进行荧光定量PCR，每个基因3次技术重复。

1.6 数据的统计与分析

采用Excel进行数据整理和误差分析，采用单因素方差分析（ANOVA）及最小显著差异多范围检验（P＜ 0.05）对处理间的差异进行统计分析。统计分析和绘图主要由SPSS12.0和Sigmplot完成。

2 结果与分析

2.1 萌发速率和相对萌发率

从6个品种的萌发曲线和萌发率（图1和附表1，见首页OSID二维码）。在25℃和20℃条件下，6份油菜品种萌发试验第3 d，越优1203和浙油51萌发率偏低，分别是68%和40%，越优1301萌发率约86%，越优1510，越优花叶15和沣油737萌发率均达到90%以上。萌发至第5 d，6个品种萌发已基本稳定，达到自身萌发最高值，浙油51为78%，越优1203为88%，其余品种平均达到90%以上。随着处理温度降低，在15℃、10℃、7.5℃和5℃条件下，6个品种的最终萌发率逐渐下降。15℃条件下，萌发至第10 d，除浙油51外，其他5个品种均保持较高萌发水平，基本接近25℃和20℃条件下的萌发率；10℃和7.5℃条件下第10 d，越优1510和越优1301仍分别达到92%~82%和88%~87%的萌发率，越优1203和越优花叶15仍有70%和50%以上的种子萌发，沣油737达到49%~34%，浙油51达到51%~39%。但当温度下降到5℃时，种子萌发严重受阻，至第12 d，越优1301和越优1510分别达到78%和58%的萌发率，越优1203和越优花叶15萌发率分别为24%和19%，而沣油737和浙油51萌发率仅为4%和9%。
Fig. 1 Low temperature germination ability of rapeseed seeds of different genotypes
Note: YY1301: Yueyou 1301; YY1510: Yueyou 1510; YYHY15: Yueyou huaye 15; YY1203: Yueyou 1203; FY737: Fengyou 737; ZY 51: Zheyou 51; Lowercase letters above the bars indicated significance at 0.05 according to t-test

图1 不同基因型油菜种子低温萌发能力

注：YY1301：越优1301；YY1510：越优1510；YYHY15：越优花叶15；YY1203：越优1203；FY737：沣油737；ZY51：浙油51；误差线上的小写字母表示在P< 0.05 水平上差异显著

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为客观评价各品种种子萌发时对温度的响应，排除种子在收获和干燥过程中可能发生的操作失误导致的自身萌发率的差异，进一步以25℃为参照，分析比较不同温度下各品种的相对萌发率（图1B~1F、附表2，见首页OSID二维码）。20℃第5 d，6个品种最终的相对萌发率无显著差异。在15℃条件下，6个品种的相对萌发率和萌发速率均较25℃和20℃有所下降。沣油737萌发速度较快，第3 d相对萌发率即达到90%，其余品种均在74%以上，除越优1203外，其它品种间无显著差异。第5~8 d，越优1203和浙油51的相对萌发率显著低于其他4个品种，分别是57%~77%和48%~71%，其余品种至第8 d均达到90%以上（图1C）。
Table 2 Primers used for RT-PCR verifying

表2 RT-PCR 验证引物

引物名称

Name

上游引物序列

Forward primer sequence （5΄–3΄）

引物名称

Name

下游引物序列

Reverse primer sequence （5΄–3΄）
ncbi_106370611-F GAATACGCAGCTGGAGGAGA ncbi_106370611-R CTCCTGAAATGAGTTGCTGGA
ncbi_106420290-F CGGAGAAAATCGTTGTGGCT ncbi_106420290-R TGAATCCGGTCTAGCTCGTC
ncbi_106447343-F GTCTTTGGTGGTGGTGGTTC ncbi_106447343-R GATGGAAGTGTCAACGAGCC
ncbi_106365510-F TCGCTATGAACAACGCAGAC ncbi_106365510-R TCATGTCTGCTCCAGGTGAG
ncbi_106376923-F ATGGACGGTCAGGATTCGAG ncbi_106376923-R ATCACCTTTGCACTTCTCGC
MSTRG.48536-F GCGAACGTATTGTGCCTGAT MSTRG.48536-R CGAACGGCTAAAGACCCATG
BRactin-F GGCTCCTCTTAACCCAAAGGC BRactin-R CACACCATCACCAGAATCCAGC
当温度下降至10℃时，所有品种的萌发速度均受到明显抑制，浙油51在第3 d相对萌发率分别从15℃条件下的90%和86%下降至44%和0%，最终相对萌发率也仅达到50%和66%；越优1510和越优1301在第5 d相对萌发率分别达到76%和72%，且持续至第10 d达到94%和97%；越优1203第5 d相对萌发率也已达到59%，至第10 d达到82%，越优花叶15第5 d后一直维持在75%~79%的萌发水平（图1D）。当温度继续下降至7.5℃，所有品种在第10 d才基本完成萌发，浙油51在第5 d时仍未萌动，第10 d才达到最大相对萌发值的50%，而沣油737在第5 d相对萌发值已达到31%，接近最大值，表明沣油737本身对萌发响应较快，但萌发率受到低温影响下降明显。越优1301和越优1510表现较好，在第8~10 d分别达到83%~95%和71%~84%，越优花叶15和越优1203在第8~10 d分别达到60%和58%（图1E）。在5℃极端低温条件下，越优1301在第8 d具有16%的相对萌发率，其余品种均未萌发，其中浙油51第10 d后开始萌发，越优1301和越优1510第12 d相对萌发率达到85%和59%，越优1203和越优花叶15达到27%和19%（附表1，见首页OSID二维码）。

2.2 SOD、CAT酶活性和GSH、AsA含量测定

在非生物胁迫刺激下，抗氧化系统被启动，SOD和CAT活性、GSH和AsA含量发生变化。图1结果显示，在7.5℃第8 d 4个越优品种与沣油737和浙油51的相对萌发率差异显著，以25℃为参考基准，计算7.5℃处理下各生理指标的相对增长率（图2）。温度下降导致所有油菜生理指标发生不同程度变化，越优系列品种SOD相对增长率显著高于其他2个品种，对比7.5℃处理第8 d各品种相对萌发率（图1E），SOD相对增长率与相对萌发率变化一致。而两个温度下各品种CAT、GSH和AsA含量变化与图1中相对萌发率变化无明显关联（图2B、D），如沣油737在7.5℃条件下，相对萌发率显著低于所有越优品种，与浙油51无明显差异，但CAT相对增长率却显著高于除越优1510以外的所有品种，AsA的相对增长率显著高于除越优1301以外的所有品种。分析7.5℃时的GSH相对含量，沣油737和浙油51品种和低温下种子萌发力相对较弱的越优花叶15值显著低于其他3个越优品种，而越优1203又显著高于越优1510和越优1301。以上结果说明，低温胁迫导致油菜抗氧化系统启动，不同基因型品种抗氧化能力差异显著。
Fig. 2 Changes of antioxidant physiological indexes in different genotypes of rapeseed under low temperature conditions
Note: YY1301: Yueyou 1301; YY1510: Yueyou 1510; YYHY15: Yueyou huaye 15; YY1203: Yueyou 1203; FY737: Fengyou 737; ZY 51: Zheyou 51; Letters above the bars indicate significance at 0.05 according to t-test

图2 不同基因型油菜低温下抗氧化生理指标

注：YY1301：越优1301；YY1510：越优1510；YYHY15：越优花叶15；YY1203：越优1203；FY737：沣油737；ZY51：浙油51；误差线上的字母表示在P< 0.05 水平上差异显著

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2.3 RNA-seq 的分析

2.3.1 测序数据质量评估及质控分析

根据表型鉴定结果显示，越优1301和沣油737在常温下具有较高萌发率，但沣油737在小于10℃低温下，萌发率显著下降，而越优1301萌发率仍维持相对较高水平。为进一步分析油菜低温萌发的生物学过程，选取上述两个品种为材料，以20℃为对照（CK），7.5℃为处理（T），对萌发第8 d的越优1301和沣油737进行RNA-seq分析。本研究中每个转录组样本获得6.05G的Clean bases，与甘蓝型油菜参考基因组比对成功率为90.78%~92.49%。PCA结果显示，越优1301和沣油737的CK在同一主成分，而处理组被划分在两个不同主成分中，且样本的重复性较好（图3A）。以上结果表明整体测序质量良好，数据可用于后续生物信息学分析。
Fig. 3 PCA analysis of transcriptome samples and Venn diagrams of DEGs
Note: FYCK and YYCK represent normal temperature control of Fengyou 737 and Yueyou 1301, respectively; FYT and YYT represent low temperature treatment of Fengyou 737 and Yueyou 1301 respectively

图3 转录组样品PCA分析和DEG韦恩图

注：FYCK和YYCK分别代表沣油737和越优1301的常温对照；FYT和YYT分别代表沣油737和越优1301的低温处理

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2.3.2 差异基因表达分析

在数据库中对106 666个基因进行了功能注释，转录组比较组为YY1301CK/T、FY737CK/T、YY1301T/FY737T和YY1301CK/FY737CK。差异基因分析结果如图3B所示，低温处理后越优1301与对照组相比（YY1301CK/T），有432个DEG上调，1368个DEG下调，沣油737与对照相比（YY737CK/T）有1090个DEG上调，1156个DEG下调，说明越优1301和沣油737萌发过程中大量基因对低温响应。在YY1301T/FY737T组中去除未受温度影响YY1301CK/FY737CK组中的DEG，剩余部分与YY1301CK/T和FY737CK/T均存在交集的DEG分别有853、5和52个，共计910个DEG，这些DEG是越优1301和沣油737在低温胁迫过程中表达水平显著变化的基因，可能是导致越优1301和沣油737耐冷性差异的重要原因。

2.3.3 差异基因GO和KEGG分析

对图3B中筛选的910个DEG进行GO和KEGG分析，结果显示，80%的DEG属于生物学过程分类，主要的term涉及对单细胞有机体过程（single-organism process）、刺激反应（response to stimulus）、代谢过程（metabolic process）等（附图1，见首页OSID二维码）。KEGG分类统计，发现这些DEG显著富集的通路主要是代谢途径（metabolic pathways）、次生代谢物的生物合成（biosynthesis of secondary metabolites）、植物激素信号转导（plant hormone signal transduction）、MAPK信号通路-植物（MAPK signaling pathway - plant）、淀粉和蔗糖代谢（starch and sucrose metabolism）等（附图1）。代谢途径分析表明，DEG除了主要富集在次生代谢途径之外，还富集在与低温萌发相关的激素信号转导和糖类代谢途径上，说明越优1301和沣油737低温萌发的差异可能与这两个途径相关。

2.3.4 激素信号转导和糖类代谢途径

KEGG结果中同时检测到植物激素（ABA）信号转导（ko04075）和MAPK信号转导（ko04016）两条调控途径，且两者存在PYR/PYL/RCAR┤PP2C┤SnRK2-ABF/AREB重叠调控通路，12个DEG在YY1301CK/T和FY737CK/T对比中存在显著差异（图4）。例如ncbi_106351036、ncbi_106368964、ncbi_106391984等为PP2C调控基因，这些基因在耐冷材料越优1301中表达量显著低于沣油737。ko04075途径中ABF/ABRE调控下游靶基因，间接调控植株气孔关闭和种子休眠，ko04016途径则通过MAPK信号通路间接调控相关基因响应低温应答，说明ABA途径同时参与种子萌发和耐冷胁迫两条通路，而该途径中存在的DEG可能为越优1301和沣油737在7.5℃条件下低温萌发能力显著差异的主要原因之一（图4）。
Fig. 4 Phytohormone (ABA) signal and MAPK signal transduction metabolic pathways
Note: FY: Fengyou 737; YY: Yueyou 1301; CK: normal temperature control; T: low temperature stress; (ko04075) and refer to KEGG database. The ncbi number represents differentially expressed genes found between YY and FY in ko04075 (plant hormone ABA signal transduction) and ko04016 (MAPK signal transduction); FPKM: gene expression level of each sample. The position marked by the gene is the regulatory site of the gene in the pathway

图4 植物激素（ABA）信号转导和MAPK信号转导代谢途径

注：FY：沣油737；YY：越优1301；CK：常温；T：低温；植物激素（ABA）信号转导（ko04075）和MAPK信号转导（ko04016）参考KEGG数据库。ncbi_基因号：在ko04075 和ko04016中检索到的存在于YY和FY之间的差异表达基因；FPKM：各样本的基因表达水平；基因所标注位置为通路中该基因调控的作用位点

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在蔗糖代谢pathway中，检测到9个在越优1301和沣油737中存在差异表达的基因（图5）。MSTRG.48536为已克隆基因葡萄糖苷酶19（BGLU19），该基因在拟南芥和烟草的晚熟和干燥种子中特异性表达，但油菜中未见报导。ncbi_106376923和ncbi_106391159被注释为β-葡萄糖苷酶19异构体X1，ncbi_106397904为α-海藻糖-磷酸合酶，ncbi_106365510为蔗糖合成酶。这些DEG在YY1301CK和FY737CK中无显著差异，表明这些糖类相关的DEG表达量不同是由于温度变化引起的。有趣的是，这些DEG除ncbi106351287以外，在沣油737中的表达水平显著高于耐冷材料越优1301，推测这些基因可能通过糖代谢负调控甘蓝型油菜种子低温萌发。
Fig. 5 Sucrose metabolism pathway
Note: FY: Fengyou 737; YY: Yueyou 1301; CK: normal temperature control; T: low temperature stress; Sucrose metabolism pathway (ko00500) refer to KEGG database. The ncbi gene number represents differentially expressed genes found between YY and FY in ko00500; FPKM: gene expression level of each sample. The position marked by the gene is the regulatory site of the gene in the pathway

图5 蔗糖代谢途径

注：FY：沣油737；YY：越优1301；CK：常温；T：低温；蔗糖代谢途径（ko00500）参考KEGG数据库；ncbi_基因号：在ko00500中检索到的存在于YY和FY之间的差异表达基因；FPKM：各样本的基因表达水平；图中基因所标注位置为通路中该基因调控的作用位点

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2.3.5 差异表达基因的 RT-PCR 验证

在上述植物激素信号转导途径和蔗糖代谢途径中共获得的21个DEG，为了验证转录组测序基因差异基因表达的可靠性，随机选取6个DEG，ncbi_106370611（SRK2E）、ncbi_106420290（蛋白磷酸酶2C）、ncbi_106447343、ncbi_106365510（蔗糖合酶3）、ncbi_106376923（β-葡萄糖苷酶异构体）、MSTRG.48536（BGLU19）进行RT-PCR验证（引物见表2）。由图6可看出RT-PCR测定的9个DEG的表达水平趋势与转录组测序基因的表达趋势一致，增加了本研究中DEG的可靠性。
Fig. 6 Validation of DEGs using quantitative real time RT-PCR
Note: YY1301: Yueyou 1301; FY737: Fengyou 737; Asterisk above data bars indicate significance at 0.05

图6 差异表达基因的RT-PCR验证

注：YY1301：越优1301，FY737：沣油737；*代表P< 0.05水平上差异显著

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3 讨论

3.1 油菜品种抗寒耐迟播表型特征和遗传背景

低温胁迫延缓种子萌发速度、降低发芽率，从而对植株后期生长发育造成不良影响。本研究发现，不同基因型油菜萌发特性存在差异，低温下种子萌发速率和最终萌发率是决定其抗寒能力的关键，萌发迅速可以躲避播种后气温骤降导致的种子萌发受阻，而高萌发率则可保证稳定低温条件下油菜的出苗率。沣油737[26]目前是我国广泛种植的品种，研究结果表明其具有萌发速率快，且10℃以上萌发良好的特性；浙油51是浙江省目前种植面积最大的主导品种[27]，研究显示温度低于15℃，浙优51萌发能力严重下降；越优1510和越优1301耐寒能力相对较强，但萌发速率比沣油737低。本研究中所检测的越优系列杂交油菜，是近年来浙江省农业科学院应用自主发明的分子标记辅助育种专利技术[28]，将德国NPZ育种公司发明的MSL不育系统中的2个育性相关基因导入浙双72等骨干大品种中，育成MSL72A等不育系，进而配制组合育成越优1203、越优1301、越优1510等多个越优系列新品种。MSL原始不育系为典型欧洲冬油菜类型，具有较强的抗寒耐冻特性，通过标记辅助回交转育不育基因片段时可能保留了连锁的抗寒基因。

3.2 越优1301萌发期耐寒的调控网络

目前，研究发现植物通过细胞调节机制[29,30]、膜组成变化[31]和活性氧清除系统的激活[32]响应冷胁迫，这些生物学过程涉及光合作用、抗氧化系统和能量代谢[33]。激素信号转导（ko04075）和MAPK信号转导（ko04016）是植物抗逆反应中重要的调控途径，本研究中检测到12个DEG参与上述反应，主要集中在PYR/PYL/RCAR┤PP2C┤ SnRK2阶段。ncbi106357573基因影响ABA与其受体PYR/PYL/RCAR结合，而PYR/PYL/RCAR与PP2C发生互作，抑制PP2C与SnRK2结合，这个过程中有ncbi_106351036等6个DEG被检测到，且在越优1301的表达水平显著低于沣油737，其原因可能是该过程为反向调控油菜耐寒性所致，SnRK2可磷酸化转录因子（如AREB和ABF），被磷酸化的转录因子激活ABA响应基因的表达，提高水稻耐低温能力[10]，我们检测到与SnRK2相关基因ncbi_106380611在越优1301中高表达，功能注释显示ncbi_106380611为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SRK2E，是钙非依赖性ABA活化蛋白激酶，上述基因在品种间表达量的显著差异与萌发率表型结果一致。本研究中没有检测到非ABA途径的DEG，表明在越优1301和沣油737的耐冷差异表现中起主要作用的可能是依赖ABA途径。

3.3 越优系列品种迟直播临界期和合理播种量

国家对油菜种子常温下发芽率的标准是不低于80%[34]，评价品种抗寒性强弱的重要指标之一即是种子在低温下的萌发能力，不同基因型间存在差异。根据本实验结果，我们拟定相对萌发率大于70%，萌发时间不长于8 d为参考标准确定播种的临界温度和播种期。根据上述标准，沣油737临界萌发温度为10℃以上，浙油51临界萌发温度为15℃以上；越优1203和越优花叶15临界温度为10℃；越优1301和越优1510临界温度为7.5℃。本研究为了提出一个可供参考的长江下游各地区油菜迟直播的临界播种期，统计了杭州、湖州、宁波、衢州四个地处浙中、浙北、浙东、浙西的油菜产区和南京、合肥二省会城市近5年10月16-11月30日共计45 d的日最高温度和最低温度（附表3，见首页OSID二维码）。该气象数据结合本研究结果，我们认为沣油737和浙油51在浙北地区和安徽、江苏10月底前播种较为安全，在浙江省内的其它地区不能迟于11月5日；越优1203和越优花叶15两品种在浙北地区建议不迟于11月10日播种，在安徽、江苏不迟于11月5日，在浙江省内其他区不迟于11月15日播种；越优1510和越优1301在浙北长兴、安徽和江苏建议临界播种期可尝试推迟至11月15日，在浙江省内其他油菜产区可至11月底。在一定温度范围内，生产上一般通过增加播种量来弥补低温导致芽率下降和苗数不足的问题，本研究提出的临界播种温度是以相对萌发率约70%为依据，因此，迟直播情况下播种量至少加量30%~50%，随播种期后延，播种量相应增加。本研究为实验室条件下结果，提供大田生产参考。

4 结论

越优1301和越优1510在10℃以下表现出相对较强的耐寒性。长江下游油菜生产上可根据不同品种的生长发育规律，在迟播农田推广种植越优1301等杂交油菜品种，可有效降低低温导致的萌发不利的问题。检测到激素信号、MPKA信号、蔗糖代谢等主要调控途径参与油菜种子低温萌发过程，解释了越优1301和沣油737低温萌发过程的差异，同时鉴定了21个与耐冷相关新基因，这些候选基因的表达可能是越优1301表现强耐寒性的原因。

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