Effects of salt/alkali-tolerant phosphate-solubilizing bacteria on lipid metabolome of soybean seedlings

Mei-zhen ZHANG; Li-na WANG; Wei ZHAO; Di GAO; Yu-xian ZHANG; Kui-de YIN

doi:10.19802/j.issn.1007-9084.2022274

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CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2023, Vol. 45 ›› Issue (6) : 1284-1294. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2022274

Effects of salt/alkali-tolerant phosphate-solubilizing bacteria on lipid metabolome of soybean seedlings

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Abstract

Lipid metabolism plays an important role in plant response to abiotic stress. Four salt/alkali-tolerant phosphate-solubilizing bacteria strains （W5, Y7, Y14 and Y31, with Latin names of Bacillus siamensis, Pseudomonas sp., B. wiedmannii and Acinetobacter sp., respectively） screened in the previous study were used for soybean pot experiment to investigate the effects of phosphate-solubilizing bacteria （PSB） on the growth of soybean plants under salt/alkali conditions, and to analyze the changes of lipid compounds in soybean leaves. The results showed that the chlorophyll content, plant height, root length, shoot fresh weight, shoot dry weight, root fresh weight and root dry weight of soybean were increased after trwatment with the four strains, and the Y7 strain treatment group had the best effect. The Y7 strain treatment group was selected for soybean leaf lipid metabolism analysis. It showed that a total of 429 lipids were detected, and 30 significantly different metabolites （16 up-regulated and 14 down-regulated） were screened in the Y7 strain treatment group. The metabolic pathways with the largest enrichment of differential metabolic pathways were glyceride metabolism from lipid metabolism, in which the content of diglyceride （DG） was significantly increased, the content of triglyceride （TG） was significantly decreased, and the total content of phosphatidylethanolamine （PE）, phosphatidylcholine （PC） and phosphatidylserine （PS） was significantly increased, and the total content of phosphatidic acid （PA） and phosphatidylinositol （PI） total compounds was significantly decreased. The comprehensive results showed that salt/alkali-tolerant phosphate-solubilizing bacteria applied to salt/alkali soil had obvious growth promotion effect on soybean and affected soybean leaf lipid metabolic pathways and products.

Key words

phosphate-solubilizing bacteria / soybean / growth promotion / lipid metabolome

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Mei-zhen ZHANG , Li-na WANG , Wei ZHAO , Di GAO , Yu-xian ZHANG , Kui-de YIN. Effects of salt/alkali-tolerant phosphate-solubilizing bacteria on lipid metabolome of soybean seedlings[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2023, 45(6): 1284-1294 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2022274

盐碱胁迫是一种严重影响植物生长发育的非生物胁迫。全球盐碱土面积达到了9.32亿公顷，其中中国盐碱土面积约1亿公顷，占全球盐碱土面积的1/10左右^{[1, 2]}，严重制约了我国的经济发展。磷是调节植物蛋白质合成，使植物正常生长发育所必需的营养元素。除此之外，磷还与豆科植物的复杂信号转导、大分子生物合成、能量转化、呼吸和固氮有关^[3]。由于土壤中的磷会被其他化合物固定，导致土壤中有效磷含量很低^[4]。高pH值的盐碱土，有机质含量少，易板结，导致土壤缺磷更加明显^[5]。溶磷菌是一种有益促生菌，它可以通过改良土壤环境以及植物内部激素水平等方式来促进植物生长^{[6, 7]}。

代谢组学是指对某一生物在特定时期内所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的一门学科。脂质组学作为代谢组学的一个分支，是对脂质化合物进行定性定量测定并分析其在不同生理或病理条件下变化的方法学。脂质是生命体内的营养物质之一，它是一类难溶于水易溶于有机溶剂的重要化合物。脂质主要分为8个大类：脂肪酸类、甘油酯类、甘油磷脂类、鞘脂类、糖脂类、聚酮化合物、甾醇脂质以及异戊烯醇酯^[8]。脂质不仅是生物膜的重要组成部分，还为生命体提供能量和碳储备，在介导细胞信号通路以及调节应激反应等方面发挥重要作用^[9]，特别在植物适应环境的过程中显得尤为重要。有研究表明，大叶山蚂蝗在低磷胁迫下，可以通过加强叶片中含磷脂质的降解以及不含磷脂质的积累来响应低磷胁迫^[10]；干旱胁迫下，小麦幼苗通过降解磷脂来适应胁迫环境^[11]；还有研究表明，植物可以通过提高脂质代谢水平来增强植物的耐盐性^[12]。磷元素参与了磷脂的合成，磷脂也是生命活动所必需的重要物质^[13]。高等植物叶片中贮存大量的有机磷，其中磷脂占叶片全磷的15%~20%^[14]。因此，磷的供应能直接影响到植物叶片磷脂的含量以及合成。

大豆是豆科的一年生草本植物，是中国重要粮食兼油料作物之一，但我国大豆种植面积有限，总产量偏低，大部分大豆需要进口^[15]，所以提高我国大豆产量非常必要。磷是决定豆科植物产量的主要营养物质，缺磷会使植物叶面积减小^[16]，降低干物质的积累^[17]、影响植物的光合能力^[18]等。在盐碱土中大豆吸收磷更加困难，而溶磷促生菌可以增加土壤有效磷的含量、提高土壤肥力、增强土壤微生物活性、增加植物耐盐碱性、缓解盐碱胁迫对其的危害，进而促进植株生长，它还可以通过酶解、酸化、螯合和离子交换反应等溶解土壤中的不溶性磷酸盐^[19]。武志海^[20]等的盆栽试验结果表明，施加外源溶磷菌可以增加盐碱土中有益微生物的数量、土壤酶活性及微生物群落的多样性来改善盐碱土，促进大豆生长。Adnan等^[21]的研究表明，溶磷菌可以增强植物耐盐碱性、提高作物产量。截至目前为止，脂质组学的研究在植物质膜方面的研究较多，但针对施入菌株后对植物叶片的脂质代谢有什么影响并无相关报道。因此，本研究对盐碱条件下施入溶磷菌后大豆在生长和叶片脂质变化方面进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 大豆品种

供试大豆品种为绥农28。

1.1.2 土壤概况

种植土壤为轻度盐碱土，采集于黑龙江省大庆市龙凤区植被生长较好的盐碱地草原，选择碱草生长较好的草地，采用五点取样法挖取植被下20 cm土壤，去除根系，混匀，带回实验室，土壤过筛备用，土壤理化性质如表1所示。

Table 1 Physical and chemical properties of soil in pot experiment

表1 盆栽试验土壤理化性质

碱解氮含量/（mg/kg）

Available N content

有效磷含量/（mg/kg）

Available P content

速效钾含量/（mg/kg）

Available K content

有机质含量/（mg/kg）

Organic matter content

可溶性盐含量/%

Soluble salt content

8.48

115.0

16.5

267

31.20

0.15

1.1.3 菌种来源

试验所用菌株W5、Y7、Y14、Y31由本实验室前期从大庆市高新区的盐碱地植物根际土筛选获得，菌株W5为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）、Y7为假单胞菌（Pseudomonas sp.）、Y14为威兹曼芽孢杆菌（Bacillus wiedmannii）、Y31为不动杆菌（Acinetobacter sp.）。经前期鉴定发现4株菌溶磷量均较高，W5、Y7、Y14和Y31的溶有机磷量分别达到128.63、456.35、304.42和400.44 mg/L，经耐盐碱试验发现4株菌均能在pH值=10及NaCl含量为7%的培养基中生长。

1.2 方法

1.2.1 盆栽试验

用取回的轻度盐碱土作为种植大豆的盆栽土，盆栽试验共设置1个对照和4个溶磷菌处理，每个处理4次重复。对照（CK）正常浇水、处理1（T1）施入菌株W5、处理2（T2）施入菌株Y7、处理3（T3）施入菌株Y14、处理4（T4）施入菌株Y31。每盆土重8.5 kg，每盆播种30粒大豆，出苗后，对照组浇水500 mL，处理组施入10⁷ cfu/mL（每毫升含有细菌群落数量）的菌液500 mL（菌株用LB培养基培养48 h后收集菌体用无菌水调节浓度），置于室外培养，出苗10 d后再补浇1次500 mL菌液。日常管理中处理与对照浇灌相同的水量，大豆生长40 d后取样测定大豆生长指标、叶绿素含量相对值（SPAD）和叶片脂质代谢组。

1.2.2 生物量测定

将样品地上与地下部分分开，分别称量鲜重、测量株高和根长，然后将样品放入烘箱中105℃杀青20 min，70℃恒温烘干至恒重后称量干重。

1.2.3 脂质代谢物提取

脂质代谢物的提取参照郑韶爵等^[10]方法进行，略作修改：称取50 mg样本到1.5 mL EP管中，加入内标20 μL（Lyso PC-17:0, 0.1 mg/mL, 甲醇配置）和300 μL甲醇-水（V∶V=1∶1）；加入两个小钢珠，放入研磨机研磨（60 Hz，2 min）；加入300 μL氯仿，涡旋振荡30 s，超声提取10 min，-20℃静置20 min；离心10 min（13 000 r/min，4℃）取180 μL下层氯仿层装入LC-MS进样小瓶中；在取完下层溶液的离心管中继续加入300 μL氯仿-甲醇（V∶V=2∶1）, 进行水浴超声；-20℃静置20 min，离心10 min（3 000 r/min，4℃），取180 μL下层氯仿层，继续放入原来的LC-MS小瓶中挥干；挥干后，LC-MS小瓶中的脂质残渣用300 μL异丙醇-甲醇（V∶V=1∶1）复溶（涡旋30 s，超声提取3 min），将溶液转移至1.5 mL EP管中，-20℃静置2 h；离心10 min（13 000 r/min，4℃），取150 μL上清液装入带内衬管的LC-MS进样小瓶中，用于LC-MS分析；由于本试验样本总数少于10个，所以不做QC（质量控制）样本。

1.2.4 分析条件

色谱分析采用BEH C8柱（100 mm×2.1 mm, 1.7 μm，Waters，USA）进行UPLC分析。柱温：55℃；流动相A：乙腈：水=6:4 （V/V，含10mmol/L 乙酸铵，0.1%甲酸）；流动相B：异丙醇:乙腈=9:1 （V/V，含10 mmol/L 乙酸铵，0.1%甲酸）；流速：0.26 mL/min；梯度洗脱程序：0~1.5 min，32%B；1.5~15.5 min，32%~85%B；15.5~15.6 min，85%~97%B；15.6~18.0 min，97%B；18.0~18.1 min，97%~32%B；18.1~20 min，32%B。进样量：2 μL。

质谱分析分别采用加热电喷雾电离（HESI-Positive）对正离子和负离子模式进行检测。样品经Dionex U3000 UHPLC（Thermo Scientific^TM）分离后采用Q Exactive Plus（Thermo Scientific^TM）进行质谱分析。

喷雾电压正离子模式为3.5 kV、负离子模式为-3.0 kV；离子传输管温度300℃，辅助气加热器温度：350℃，鞘气流速45 Arb；辅助气体流速：10 Arb；质谱扫描电荷质量比（m/z）为150-1500；全MS分辨率：70 000 ms；MS/MS分辨率：17 500 ms；阶梯式归一化碰撞能量（NCE）值分别设置为25、35、45。

1.2.5 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2021软件进行数据统计及可视化作图；利用SPSS 21软件对大豆生长指标进行数据分析和差异显著性分析，数据以平均数±标准误表示。脂质分析采用软件Progenesis QI v2.3对原始数据进行定性及相对定量分析，并对原始数据进行标准化预处理用于后续分析。

2 结果与分析

2.1 耐盐碱溶磷菌对大豆生长的影响

在前期研究中，本实验室筛选得到4株耐盐碱溶磷菌，为检验其在盐碱土中对大豆生长的作用进行了盆栽试验。盆栽试验所使用的是轻度盐碱土，通过接种不同菌株对大豆进行处理，40 d后测定大豆植株的生长指标，盆栽试验结果如图1、表2所示。与对照（CK）相比，浇灌W5（T1）、Y7（T2）、Y14（T3）、Y31（T4）菌液的处理组大豆幼苗叶绿素含量、株高、根长、叶鲜质量、叶干质量、根鲜质量、根干质量均呈现不同程度的增加。其中与CK相比，T1、T2、T3、T4处理的叶绿素含量分别增加了0.20%、13.21%、5.29%、9.62%，株高分别增加了46.94%、46.35%、12.53%、45.45%，根长分别增加了5.40%、13.10%、4.93%、10.63%，地上部分鲜重分别增加了67.50%、64.89%、30.04%、55.28%，地上部分干重分别增加64.81%、60.55%、35.13%、50.23%，根鲜重分别增加了36.49%、59.35%、20.12%、23.44%，根干重分别增加了37.78%、53.75%、21.82%、23.29%。试验结果表明，4株菌对轻度盐碱土培养的大豆均有较好的促生作用，缓解了盐碱胁迫对大豆生长的抑制，增强了大豆的抵抗能力。4株菌中T2处理组（Y7菌株）对大豆幼苗的促生效果最好，所以选择T2处理组的大豆叶片进行脂质代谢组分析。

Fig. 1 Effect of saline-alkali-tolerant phosphate-solubilizing bacteria on soybean growth

Note: CK: normal watering; T1-T4: irrigated with W5, Y7, Y14 and Y13 salution of 10⁷ cfu/mL

图1 耐盐碱溶磷菌对大豆生长情况的影响

注：CK：正常浇水；T1-T4：分别用10⁷ cfu/mL的W5、Y7、Y14和Y13菌液浇灌

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Table 2 Effects of saline-alkali tolerant phosphate-solubilizing bacteria on soybean biomass

表2 耐盐碱溶磷菌对大豆生物量的影响

处理 Treatment	叶绿素含量（SPAD） Chlorophyll content	株高/cm Plant height	根长/cm Root length	地上部鲜重/g Aboveground fresh weight	地上部干重/mg Aboveground dry weight	根鲜重/g Fresh root	根干重/mg Root dry weight
CK	42.62±2.75c	13.41±1.43c	8.65±1.13b	0.85±0.13c	187.93±20.44b	0.30±0.10c	40.93±10.31c
T1	42.71±2.82c	19.70±1.67a	9.12±1.20ab	1.42±0.12a	309.73±55.38a	0.41±0.09ab	56.40±9.69ab
T2	48.25±2.92a	19.62±1.43a	9.79±1.49a	1.40±0.20a	301.73±23.11a	0.48±0.10a	62.93±7.98a
T3	44.88±1.96bc	15.09±2.38b	9.08±0.77ab	1.10±0.28b	253.97±47.43b	0.36±0.07bc	49.87±10.82b
T4	46.72±3.00ab	19.50±1.29a	9.57±1.67ab	1.31±0.20a	282.33±27.48a	0.37±0.10bc	50.47±11.57b

	注：同列数据后不同的小写字母表示0.05水平差异显著；CK：正常浇水；T1-T4：分别用10⁷ cfu/mL的W5、Y7、Y14和Y13菌液浇灌
	Note: different lowercase letters in same column indicate significant differences at 0.05 level; CK: normal watering; T1-T4: irrigated with W5, Y7, Y14 and Y13 salution of 10⁷ cfu/mL

2.2 大豆叶片脂质代谢成分分析

将对照组CK和施入菌株的处理组T2进行大豆叶片脂质组学分析，结果显示共检测到429种脂质分子（图2），包括9种甘油磷脂（CL、LPC、PA、PC、PE、PG、PI、PIP2、PS）、3种甘油酯（DG、MG、TG）、3种固醇脂（SiE、StE、ZyE）、4种甘油糖脂（CerG1、DGDG、MGDG、SQDG）、3种鞘脂（Cer、SM、So）、3种脂酰和其他脂类（LPMe、PEt、PMe）。

Fig. 2 Number of lipid metabolites

图2 脂质代谢物数量

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2.3 大豆叶片脂质代谢多元统计分析

PCA主要反应了样本原始数据的情况，如图3A所示。横坐标（PC1）表示第一主成分下投影的得分值为40.2%，纵坐标（PC2）是第二主成分下投影的得分值为16.1%，组内样本之间分布聚集在一起，表明本试验的重复性较好。两组之间的得分图上的位置较远表明两组处理之间存在明显差异。

Fig. 3 Multivariate statistical analysis of lipid metabolism

Note: Fig. A: PCA analysis; Fig. B: OPLS-DA analysis; Fig. C: Permutation analysis

图3 脂质代谢多元统计分析

注：图A：PCA分析；图B：为OPLS-DA分析；图C：Permutation分析

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偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）是运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样本分组之间的关系模型，来对样品进行预测。而正交偏最小二乘方-判别分析（OPLS-DA）是在PLS-DA的基础上，去除与分类信息无关的噪音，提高了模型的有效性，最大化凸显出模型内部不同组别之间的差异，其中R2Y与Q2的值越接近于1说明模型构建越好。OPLS-DA分析如图3B所示，CK与T2处理组代谢差异分析的预测能力R2Y=1，Q2=0.976，由图3A、B可以看出，本试验代谢组数据组内重复性好且样本组间存在明显差异，预测模型较好。

为防止模型过拟合，采用七次循环交互验证和200次响应排序检验的方法来考察模型的质量，未过拟合可靠模型 R2 大于 Q2，同时 Q2 的回归线与 Y 轴截距小于 0，验证结果显示（图3C），模型未发生过拟合，进一步说明建立的模型准确可靠。

2.4 大豆叶片差异脂质代谢物的鉴定

利用火山图可以对P值和Fold change值进行整合，有利于筛选差异代谢产物，如图4所示，其中红色点表示显著上调的代谢产物（FC＞1且P＜0.05），蓝色原点代表显著下调的代谢产物（FC＜1且P＜0.05），灰色点代表不显著的代谢产物。结果显示，与CK相比，施入溶磷菌的T2处理组有85个代谢产物上调，占所有代谢产物的19.81%；有51个代谢产物下调，占所有代谢物的11.89%，有293个代谢产物无显著差异，占所检测到脂质的68.30%。

Fig. 4 Sample volcano plot

图4 样本火山图

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2.5 差异脂质代谢物的筛选

VIP值可以评估具有显著差异的脂类对分组的贡献率，本研究以FC>1或FC＜1、VIP>1.0 且 T-test 的 P<0.05 为筛选差异代谢物的阈值。结果表明与CK相比，T2处理组上调表达16个代谢物，下调表达14个代谢物，差异显著代谢物共计30个，如图5所示颜色从蓝到红表示代谢物丰度从低到高，越红表示差异代谢物的表达越丰富。将筛选出的30个差异脂质进行分类，其中上调的包括6个甘油磷脂（2个PE、1个PC、1个PA、2个PS），3个甘油酯（2个DG、1个TG），2个鞘脂（2个So），5个脂酰和其他脂类（2个LPMe、3个PMe）；下调的包括3个甘油磷脂（1个PI、2个PA），7个甘油酯（6个TG、1个DG），2个固醇脂（2个SiE），1个甘油糖脂（MGDG），1个脂酰和其他脂类（PMe）。以上结果表明，与CK相比，施入溶磷菌的T2处理组中，含有磷酸基团的甘油磷脂种类增加较为明显，而甘油酯类下降较为明显。

Fig. 5 Heat map of differential lipid metabolite screening

图5 差异脂质代谢物筛选热图

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2.6 大豆叶片差异脂质分子代谢通路富集分析

结合火山图和聚类热图的数据，再对脂质代谢通路进行富集分析，挑选出前评分较高具有明显差异的代谢通路。代谢通路富集分析气泡图显示（图6），图中圆点越大越红的说明富集程度越大，代谢物数目越多，两组间的差异性较大。在脂质代谢通路中，富集程度最大，差异最明显的两条代谢通路为甘油脂代谢和甘油磷脂代谢。

Fig. 6 Bubble map of enrichment of metabolic pathways

图6 代谢通路富集气泡图

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2.7 溶磷菌对大豆叶片甘油酯含量变化的影响

根据差异代谢物筛选出的脂质分子的分析发现，大豆叶片中鉴定到10个有显著差异的甘油酯类（表3），其中包括上调的2个甘油二酯，为DG（36:6）和DG（36:5），1个甘油三酯，为TG（36:5），占差异甘油酯类的30%，下调的6个甘油三酯包括TG（52:5）、TG（56:11）、TG（54:4）、TG（54:5）、TG（54:7）和TG（54:8），1个甘油二酯，为DG（15:0），占差异甘油酯类的70%。计算甘油酯总含量变化发现，与CK相比，施入菌株的T2处理组甘油二酯总化合物含量上升明显，甘油三酯总化合物含量下降明显。

Table 3 Trends in glycerides

表3 甘油酯类变化趋势

代谢物名称 Name of metabolite	保留时间/min Retention time	质荷比（m/z）Mass-to-charge ratio	CK组代谢产物平均表达量 Mean expression of metabolites in CK group	T2组代谢产物平均表达量 Mean expression of metabolites in T2 group	VIP值 VIP value	p值 P value
DG 36：6（18：3/18：3）	7.29	630.51	208.72±56.43	387.16±43.15	4.86	0.002394557
DG 36：5（18：3/18：2）	7.65	632.52	109.07±7.26	130.50±7.15	1.65	0.005657757
DG 15：0	1.22	348.27	41.03±3.14	23.08±2.71	1.59	0.000130687
TG 36：5（4：0/15：2/17：3）	6.14	646.50	17.95±4.54	27.40±3.40	1.05	0.0157926
TG 52：5（16：0/18：2/18：3）	10.56	870.75	75.35±5.07	57.52±11.58	1.41	0.030282255
TG 56：11（18：3/18：3/20：5）	10.07	897.70	78.10±6.66	54.49±0.36	1.82	0.000399524
TG 54：4（18：0/18：2/18：2）	11.16	900.80	40.14±4.33	25.63±4.80	1.37	0.004164083
TG 54：5（18：1/18：2/18：2）	10.89	898.79	114.13±10.52	66.45±6.99	2.58	0.000279598
TG 54：7（18：3/18：2/18：2）	10.34	894.75	562.06±55.48	234.11±18.17	6.86	2.97116E-05
TG 54：8（18：3/18：2/18：3）	10.06	892.74	624.74±70.62	258.28±27.29	7.22	6.96748E-05

	注：DG为甘油二酯；TG为甘油三酯
	Note: DG is diglyceride. TG is triglyceride

2.8 溶磷菌对大豆叶片甘油磷脂含量的影响

甘油磷脂是生物膜的重要组成成分，对大豆叶片甘油磷脂进行分析，共鉴定到9个有显著差异的甘油磷脂，其中包括上调的2个磷脂酰乙醇胺，包括PE（31:0）和PE（33:1）、1个磷脂酰胆碱，为PC（30:1）、1个磷脂酸，为PA（34:1）和2个磷脂酰丝氨酸，包括PS（47:4）和PS（47:7），占显著差异甘油磷脂的66.67%；下调的1个磷脂酰肌醇（PI（34:3））和2个磷脂酸，包括PA（34:2）和PA（36:4）占显著差异甘油磷脂的33.33%，见表4。计算甘油磷脂总含量变化发现，与CK相比，施入菌株的T2处理组中的甘油磷脂类主要呈上升趋势，其中PE、PC和PS上调明显，而PA、PI呈现下调趋势，这些结果表明施入耐盐碱溶磷菌的处理对大豆甘油磷脂代谢产生了影响。

Table 4 Trends in glycerophosphatide metabolites

表4 甘油磷脂代谢物变化趋势

代谢物名称 Name of metabolite	保留时间/min Retention time	质荷比（m/z）Mass-to-charge ratio	CK组代谢产物平均表达量 Mean expression of metabolites in CK group	T2组代谢产物平均表达量 Mean expression of metabolites in T2 group	VIP值 VIP value	p值 P value
PE 31：0	7.33	678.51	81.46±20.80	154.20±11.17	3.16	0.000837827
PE 33：1	7.22	704.52	35.23±7.93	50.82±7.72	1.31	0.030453432
PC 30∶1（18：1/12：0）	7.43	704.52	37.53±10.89	68.98±7.60	2.03	0.003206859
PA 34∶1（16：0/18：1）	7.50	673.48	33.22±6.30	48.76±3.99	1.40	0.005903348
PA 34∶2（16：0/18：2）	7.23	671.47	61.16±8.79	42.05±5.89	1.54	0.011185183
PA 36∶4（18：2/18：2）	6.97	695.47	26.90±6.16	13.98±5.69	1.22	0.021658946
PS 47：4	7.53	960.67	109.59±8.68	138.52±12.04	1.89	0.008001489
PS 47：7	6.33	954.62	582.23±14.12	666.61±53.94	3.10	0.023201745
PI 34：3（16：0/18：3）	6.49	831.50	271.76±8.83	219.94±9.00	2.70	0.000174556

	注：PE为磷脂酰乙醇胺；PC为磷脂酰胆碱；PA为磷脂酸；PS为磷脂酰丝氨酸；PI为磷脂酰肌醇
	Note: PE is phosphatidylethanolamine; PC was phosphatidylcholine; PA was phosphatidic acid. PS was phosphatidylserine; PI is phosphatidylinositol

3 讨论与结论

盐碱土壤的养分含量低^[22]，同时盐碱胁迫会对植物产生渗透胁迫而直接毒害植物，制约植物的正常生长^[23]。前人研究表明，盐碱胁迫会抑制植物生长^[24]，而施入耐盐碱促生菌后，盐碱胁迫对植物的危害会有所缓解，并使植物正常生长^[25-27]。本研究也发现，在轻度盐碱土中种植大豆并施入耐盐碱菌株后，其对大豆地上部分和地下部分的生长情况均有不同程度的促进作用。脂质在胁迫响应中起到重要作用，脂质信号分子的产生受到酰基脂质代谢网络和一些专门的脂质修饰酶的严格调控^[28]。在胁迫环境中，植物会通过体内脂质含量的变化来响应这种胁迫环境。有研究表明，在低氧胁迫下，植物通过对脂质的重塑，包括各种脂类含量的改变，碳骨架的长度以及脂肪酸的饱和度来响应低氧环境^[29]。本研究脂质代谢物分析表明，与CK相比，T2（Y7菌株）处理组的大豆叶片脂质代谢物含量共有85个物质上调，51个代谢产物下调，以调节脂质代谢物种类量来响应盐碱胁迫，其中筛选出两个最为明显的代谢途径分别是甘油脂代谢和甘油磷脂代谢。

甘油酯类主要有甘油二酯（DG）和甘油三酯（TG）。DG可用于磷脂、糖脂、树脂、脂蛋白等多种化合物的合成^[30]。DG是TG中一个脂肪酸被羟基取代的结构脂质，是油脂中的天然成分，也是体内脂肪代谢的内源中间产物^[31]。TG的代谢过程通常是在专一性酶的作用下水解成2-甘油一酯（2-MG）和脂肪酸（FFA），FFA和MG通过MG酰基转移酶作用后重新酯化生成1，2（2，3）-DG，然后在DG酰基转移酶的作用下重新合成TG储存在体内^[32]。DG则通常是以1，3-DG形式水解为1（3）-MG，1（3）-MG很难作为TG再次被酯化的底物，所以参与了新的水解过程产生FFA和甘油，这些产物是3-磷酸甘油反应途径的底物，可以再次转化为1，3-DG^[33]。有研究表明，拟南芥在干燥后复水的情况下，DG为了维持膜的稳定性显著升高^[34]。还有研究表明，在多种胁迫条件下，如温度、水分、pH值等，植物能够积累TG，而在合成TG前要先形成DG^[35]。本研究发现，与CK相比，T2处理组中的DG总化合物含量上升，TG总化合物含量下降，可能是施入菌株后，缓解了盐碱胁迫对大豆的抑制作用而导致的结果。DG 用于磷脂的合成，磷脂是生物膜合成的主要组成成分，磷素能够直接影响到植物叶片磷脂的含量以及合成。有研究表明，在缺磷环境中，植物会通过降解磷脂来释放磷素，再通过合成不含磷的脂质来维持膜的完整性，帮助植物生存^[36]。植物受到盐碱胁迫时，Na⁺会不断积累并替换Ca²⁺造成离子毒害，同时植物也会受到渗透胁迫，破坏了细胞膜的稳定性。Bajwa等^[37]研究表明，磷脂酰胆碱（PC）含量的增加，降低了小麦对Na⁺的吸收，减轻离子毒害，增强了植物的耐盐性。Yu等^[38]研究表明甘薯幼苗为了响应盐胁迫，其磷脂酰丝氨酸（PS）含量与TG含量增加，提高了植物的耐盐性。Gasulla等^[39]认为PA的增加是细胞脱水的信号，是膜损伤的特征。本研究在轻度盐碱土中种植大豆并施入耐盐碱溶磷菌，耐盐碱的溶磷菌可以在盐碱土中存活，并且溶磷菌可以增加土壤中有效磷的含量，为大豆提供生长所必需磷元素。对施入菌株的大豆叶片进行脂质代谢分析发现，与CK相比，T2处理组中的PE、PC和PS总化合物含量上调明显，说明耐盐碱溶磷菌为大豆提供了磷素，使大都叶片中多种磷脂含量上升，而PA、PI总化合物含量下降明显，说明施入菌株的大豆缓解了盐碱胁迫对大豆的抑制作用，缓解了膜的损伤。

综上，本研究通过在轻度盐碱土中种植大豆并施入耐盐碱溶磷菌，4个菌株处理组的大豆叶绿素含量、株高、根长、地上部鲜质量、地上部干质量、根鲜质量和根干质量均有提高，说明溶磷菌能够提高大豆的耐盐碱性，促进大豆地上部和根的生长。对施入与未施入Y7溶磷菌的大豆叶片脂质代谢组分析表明，共检测到429个脂质，有85个上调，51个下调；将差异代谢物进行筛选，筛选得到30种差异明显的代谢物（16个上调，14个下调）。自脂质代谢中选出差异最大的代谢通路为甘油酯代谢，其中甘油磷脂种类增加较为明显，甘油酯类下降较为明显，说明施入溶磷菌可以改变大豆叶片脂质代谢物含量、脂质代谢通路。

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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 大豆品种
1.1.2 土壤概况
Table 1 Physical and chemical properties of soil in pot experiment
1.1.3 菌种来源
1.2 方法
1.2.1 盆栽试验
1.2.2 生物量测定
1.2.3 脂质代谢物提取
1.2.4 分析条件
1.2.5 数据统计分析
2 结果与分析
2.1 耐盐碱溶磷菌对大豆生长的影响
Fig. 1 Effect of saline-alkali-tolerant phosphate-solubilizing bacteria on soybean growth
Table 2 Effects of saline-alkali tolerant phosphate-solubilizing bacteria on soybean biomass
2.2 大豆叶片脂质代谢成分分析
Fig. 2 Number of lipid metabolites
2.3 大豆叶片脂质代谢多元统计分析
Fig. 3 Multivariate statistical analysis of lipid metabolism
2.4 大豆叶片差异脂质代谢物的鉴定
Fig. 4 Sample volcano plot
2.5 差异脂质代谢物的筛选
Fig. 5 Heat map of differential lipid metabolite screening
2.6 大豆叶片差异脂质分子代谢通路富集分析
Fig. 6 Bubble map of enrichment of metabolic pathways
2.7 溶磷菌对大豆叶片甘油酯含量变化的影响
Table 3 Trends in glycerides
2.8 溶磷菌对大豆叶片甘油磷脂含量的影响
Table 4 Trends in glycerophosphatide metabolites
3 讨论与结论
References

Received	Published
2022-09-29	2023-12-28
Issue Date
2023-12-28