Effects of soil-applied herbicides on bacterial community structure and diversity of rapeseed field soil

Yi LI; Wei-wei QIN; Ti-rong REN; Jia-sen CHENG; Hao LIU; Jun-bin HUANG; Lu ZHENG

doi:10.19802/j.issn.1007-9084.2022278

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CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2024, Vol. 46 ›› Issue (2) : 324-333. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2022278

Effects of soil-applied herbicides on bacterial community structure and diversity of rapeseed field soil

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Abstract

Soil sealing treatment is an effective chemical weed control method in rapeseed field. To evaluate the effects of different soil-applied herbicides on soil microorganisms in rapeseed field, 16S rRNA amplicon sequencing was used to analyze the changes in soil microbial structure and diversity after treatment with four commonly used soil-applied herbicides alachlor, acetochlor, metochlor and s-metolachlor. The results showed that soil-applied herbicide treatments could significantly reduce soil bacterial diversity in rapeseed fields, and alachlor had the greatest effect on soil bacterial diversity. However, after a period of herbicide treatment, the diversity and richness of the soil bacterial community gradually recovered. Soil-applied herbicide treatment had great influence on Actinomycetes, Acidobacteria and others in rapeseed soil, and alachlor treatment showed the greatest change in soil bacteria at phylum level compared with other herbicides. After 60 days of treatment with soil-applied herbicides, the abundances of functional bacteria related to pollutant degradation, denitrification, photosynthesis, pathogen growth inhibition and rhizosphere growth promotion were increased, whereas functional bacteria associated with the absorption of nutrients and excretion of metabolites were reduced. Overall, the results indicated that the soil-applied herbicides had a certain effect on soil microbial diversity and community structure in rapeseed field, but the effect of herbicides on soil microbial diversity gradually decreased along with the time of treatment.

Key words

rapeseed / soil sealing / herbicide / microbial community / microbial diversity

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Yi LI , Wei-wei QIN , Ti-rong REN , Jia-sen CHENG , Hao LIU , Jun-bin HUANG , Lu ZHENG. Effects of soil-applied herbicides on bacterial community structure and diversity of rapeseed field soil[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2024, 46(2): 324-333 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2022278

油菜是主要的油料作物，也是食用植物油脂和蛋白饲料的重要来源。全球有四大油菜主产区，分别是中国、欧洲、印度次大陆和加拿大；其中中国的油菜种植面积及产量世界第一，约占全世界油菜种植面积和产量的三分之一^[1]。长江中下游地区土壤肥沃、气候适宜，春季雨水集中，秋季光照充足且常有秋旱，是我国油菜生产的重要区域。杂草是目前长江中下游地区影响油菜产量的主要限制因子，杂草与油菜竞争空间、养分，严重限制油菜对肥料的利用率^[2]。

化学除草是油菜田普遍使用的除草措施，但除草剂的长期大规模使用不仅会对油菜田土壤及环境造成污染，还会导致杂草产生耐药性^[3,4]。除草剂种类通常根据油菜种植方式及油菜田杂草分布特点进行选择，按使用方法主要分为土壤封闭、茎叶除草等类型。在油菜播后芽前使用土壤封闭型除草剂处理土壤是一种有效的油菜田化学除草措施；主要的土壤封闭型除草剂有甲草胺、乙草胺、异丙甲草胺、精异丙甲草胺、异松·乙草胺等。通常而言，土壤封闭型除草剂使用时主要关注除草效果、对油菜生长和产量的影响以及土壤农残危害，而有关土壤封闭型除草剂施用对油菜土壤微生物的影响鲜有研究。

化学除草剂施用对土壤微生物的影响，是评价除草剂生态安全的重要指标之一。不同除草剂其剂量、处理时间不同，对根际土壤微生物多样性影响也有所不同^[5]。土壤封闭型除草剂异丙甲草胺在处理初期能抑制芹菜根际与非根际土壤细菌数量，但后期细菌数量有所提升^[6]；精异丙甲草胺对甜菜田土壤细菌表现为抑制作用^[7]；除草剂咪唑乙烟酸能够降低土壤微生物多样性，降低真菌与细菌的含量比值^[8,9]；除草剂氯氟吡氧乙酸对玉米根际土壤微生物多样性的影响，随施药时间变化而变化^[10]；对粘土壤土以及沙壤森林土用常规剂量的草甘膦处理发现土壤微生物群落无明显变化，高剂量处理时土壤细菌群落结构发生显著改变^[11]；二甲戊灵、二氯喹琳酸、苄嘧磺隆在试验中期对燕麦田的土壤微生物多样性影响最大^[12]；对小黑麦和豌豆根际土用草甘膦处理，微生物的群落结构及功能发生变化，但在后期变化不显著^[13]。使用常规剂量的草铵膦、草甘膦以及百草枯对香蕉土壤进行处理，60 d后通过高通量测序分析发现，土壤微生物的多样性及丰富度均无明显变化^[14]。对于目前常用的土壤封闭型除草剂，其对油菜田土壤微生物结构的影响仍不清楚。

本研究使用16S rRNA扩增子测序技术分析了四种常用土壤封闭型除草剂处理油菜土壤中细菌群落结构及多样性的变化情况，以期为油菜安全生产和提质增效提供技术支撑及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

土样取自湖北省武汉市华中农业大学校内实验基地油菜田0~20 cm深土壤，自然风干后研磨过筛（孔径=1 mm ）备用。土壤封闭型除草剂包括：43%甲草胺乳油（南通江山农药化工股份有限公司）、900 g/L乙草胺乳油（山东三农生物科技有限公司）、720 g/L异丙甲草胺乳油（山东三农生物科技有限公司）、960 g/L精异丙甲草胺乳油（先正达作物保护有限公司。

1.2 方法

1.2.1 土壤封闭处理及取样

按照土壤中不同封闭型除草剂的有效浓度设置处理：空白对照（喷水），43%甲草胺10 mg/盆、720 g/L异丙甲草胺20 mg/盆、900 g/L乙草胺15 mg/盆、960 g/L精异丙甲草胺15 mg/盆；处理后初始浸润土壤深度为0.3~0.4 cm。每个处理用风干土3 kg，置于5 L塑料盆中，控制其含水量为田间持水量的75±5%；施药量按设计的封闭型除草剂浓度分别加入所需的农药标准溶液，于施药前、施药后30 d、60 d后每盆五点取样采集不同封闭型除草剂处理后的土壤样本，每个处理采集土样充分混匀作为该处理的一个样本。每个处理三次重复，样品用液氮封存后置于-80℃保存待用。具体处理见表1。

Table 1 Herbicide treatments and sampling times

表1 封闭型除草剂处理及取样时间

处理 Treatment	药剂 Herbicide dosage	用量 /（mg /盆） Herbicide dosage / （mg / pot ）	取样时间 Sampling time （days after treatment ）
IS	无 Without		初始土壤 Initial soil
CK30	无 Without		30
CK60	无 Without		60
AL30	43%甲草胺 43% alachlor	10	30
AL60	43%甲草胺 43% alachlor	10	60
Y30	720 g/L异丙甲草胺 720 g/L acetochlor	20	30
Y60	720 g/L异丙甲草胺 720 g/L acetochlor	20	60
AC30	900 g/L乙草胺 900 g/L metochlor	15	30
AC60	900 g/L乙草胺 900 g/L metochlor	15	60
M30	960 g/L精异丙甲草胺 960 g/L s-metolachlor	15	30
M60	960 g/L精异丙甲草胺 960 g/L s-metolachlor	15	60

1.2.2 土壤微生物基因组总DNA提取及PCR扩增

采用E.Z.N.A.^®Soil DNA Isolation Kit试剂盒（OMEGA公司，美国）提取土壤微生物总DNA。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 片段大小和完整性，紫外分光光度法检测DNA纯度和浓度。以稀释至10 ng/μL的总DNA作为模板，采用引物341F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对细菌16S rRNA的V3—V4区进行PCR扩增，扩增条件为：98℃预变性2 min，98 ℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25个循环，72℃延伸5 min。将检测后的扩增产物委托上海派森诺生物科技有限公司在MiSeq测序仪（Illumina公司）上进行高通量测序。

1.2.3 高通量测序数据处理

测序数据下机后采用滑动窗口法对FASTQ格式的双端序列逐一质量筛查，利用FLASH软件（v1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对通过质量初筛的双端序列根据重叠碱基进行配对连接，根据每个样本对应的Barcode序列，将连接后的序列识别分配入对应样本，获得每个样本的有效序列。运用QIIME软件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/）识别疑问序列，调用USEARCH（v5.2.236,http://www.drive5.com/usearch/）剔除嵌合体序列以获得优质序列。

1.2.4 土壤微生物群落多样性分析

从样品中随机抽取一定序列量的数据，统计它们所代表物种数目（即OTUs数目），使用R软件（v2.15.3）以抽取的测序数据量与对应的OTUs数来构建稀释曲线（Rarefaction Curve）。以97%的序列相似度为依据，利用UCLUST序列比对工具对上述优质序列进行归并和OTU划分，并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列，基于16S rRNA细菌Silva数据库（Release115，http://www.arb-silva.de），运用RDP Classifier（version2.2，http://sourceforge. net/projects/rdp-classifier/）进行物种注释，统计每个样本在各分类水平上的群落组成。采用Mothur软件进行统计分析，用Chao1指数来反映微生物群落的丰富度，Chao1指数越大丰富度越高，用Shannon指数和Simpson指数来表示群落多样性，Shannon指数越大而Simpson指数越小则多样性越大。基于门和属分类水平对各样本物种组成及相对丰度进行统计，基于属水平对两组样本进行差异分析，用T检验比较微生物相对丰度在两样本间的差异，当P<0.05时认为差异达到显著水平。PCA（Principal components analysis）分析主要是为了研究不同样品或处理组之间的物种群落结构差异，用于检验样本分类是否合理。PCA分析将样本间的众多物种差异特征重新做线性组合，导出少数几个相互无关的的综合指标，使其尽可能多地保留原本的信息；这些指标便称为主成分，依据各样本在这些主成分指标上的得分对其进行排序，可量化展示样本间物种组成的差异程度。在PCA分析中样品点之间的距离越近，说明样品之间物种组成结构越相似。非量度多维尺度分析（NMDS）与PCA分析类似，对样本距离矩阵作降维分解，简化数据结构，分析微生物群落的组成差异。NMDS分析不受样本距离的数值影响，对于结构复杂的数据，排序结果更稳定。NMDS结果的应力值（Stress）越小越好，一般认为当该值小于0.2时，NMDS分析的结果较可靠。由于NMDS采用等级排序，因此可近似认为两点之间的距离越近（远），表明两个样本中微生物群落的差异越小（大）。

2 结果与分析

2.1 扩增子测序数据分析

为探明不同土壤封闭型除草剂对油菜田土壤中微生物群落的影响，以各处理土壤总的DNA为模板，扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区并进行高通量测序（表2）。测序共产生1 988 181条原始双末端读长，对序列进行质控和优化处理后得到1 928 329条有效序列。其中初始土壤样品有145 346条；甲草胺处理30 d土壤样品152 652条，处理60 d土壤样品149 131条；异丙甲草胺处理30 d土壤样品152 188条，处理60 d土壤样品214 618条；精异丙甲草胺处理30 d土壤样品135 632条，处理60 d土壤样品186 208条；乙草胺处理30 d土壤样品170 727条，处理60 d土壤样品232 610条；不施除草剂30 d土壤样品163 267条，不施除草剂处理60 d土壤样品225 950条；所有样品平均序列数为58 434条，平均序列长度为416 nt。在97%相似度的OTUs分类水平下，细菌的稀释曲线逐渐趋向平缓（图1）。因此，本研究中各处理测序数据量已达到微生物组分析要求，可用于后续分析。

Table 2 Quality control and preprocessing of high-throughput sequencing datasets

表2 扩增子测序数据的质控和预处理

处理 Treatment	总序列数 Total sequence number	有效序列数 Valid sequence number	平均序列长度/nt Mean sequence length	有效率/% Validation rate
IS	60 195	57 728	416	95.90
	47 101	45 018	416	95.58
	44 096	42 600	416	96.61
CK30	57 566	55 778	416	96.89
	57 845	56 197	415	97.15
	52 722	51 292	416	97.29
CK60	69 479	67 018	416	96.46
	84 263	82 512	416	97.92
	78 388	76 420	416	97.49
AL30	50 820	49 176	415	96.77
	48 289	46 535	416	96.37
	58 981	56 941	415	96.54
AL60	51 301	49 990	416	97.44
	53 653	52 512	416	97.87
	47 653	46 629	415	97.85
Y30	52 940	51 189	416	96.69
	50 345	48 985	416	97.30
	53 844	52 014	417	96.60
Y60	63 173	60 950	416	96.48
	83 705	81 251	416	97.07
	74 268	72 417	416	97.51
AC30	60 188	58 562	416	97.30
	58 820	57 332	416	97.47
	56 323	54 833	415	97.35
AC60	77 772	75 665	416	97.29
	81 608	80 157	416	98.22
	78 821	76 788	416	97.42
M30	47 463	45 796	415	96.49
	47 891	46 515	415	97.13
	44 986	43 321	416	96.30
M60	65 669	63 322	416	96.43
	74 374	72 194	417	97.07
	53 639	50 692	415	94.51

Fig. 1 Bacterial rarefaction curves of soil samples from rapeseed field

图1 油菜田土壤细菌群落样品稀释曲线

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2.2 土壤封闭型除草剂对油菜土壤细菌群落α多样性的影响

在97%相似度下对细菌OTU进行聚类分析（图2），共获得52 820个特异性OTU，其中各土壤封闭型除草剂处理间共有的OTU为766个，约占每个处理OTU总数的10%~20%，共有OTU占每个处理总OTU数目较少。处理30 d和60 d后，空白处理对照（CK30、CK60）与初始土壤（IS）相比均有所减少；说明随着时间推移，土壤中细菌群落会发生变化。处理30 d后，在各除草剂处理中，甲草胺处理减少最多，与同时期空白处理对照（CK30）相比减少889个OTU；精异丙甲草胺处理的OTU减少最少，仅减少105个OTU。处理60 d后，甲草胺和乙草胺处理与同时期空白处理对照（CK60）相比，OTU数量降低；而异丙甲草胺和精异丙甲草胺的OTU数量有所增加，高于同时期空白处理对照（CK60）。说明不同土壤封闭型除草剂的施用可能对不同土壤细菌的影响差异较大，进而改变微生物群落结构。

Fig. 2 Venn diagrams showing numbers of shared and unique OTUs from different soil-applied herbicide treatments

图2 韦恩图展示不同土壤封闭除草剂处理土样共有及独有细菌OTUs

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对不同土壤封闭型除草剂处理后的土壤细菌进行α多样性分析，结果表明（表3），处理30天后，与同时期空白处理对照（CK30）相比，各封闭除草剂处理的Chao1指数均显著减少，丰富度显著下降，其中精异丙甲草胺处理后Chao1指数下降最多，比CK30减少17.05%；除精异丙甲草胺处理的Shannon指数有显著下降以外，其余处理的Shannon指数、Simpson指数均无显著差异。处理60天，与处理30天相比，Chao1指数均有所增加，Shannon指数也相应增加。其中，甲草胺、精异丙甲草胺、乙草胺处理样本Chao1指数增加显著，异丙甲草胺、精异丙甲草胺、乙草胺处理样本Shannon指数增加显著。由此可知，土壤封闭型除草剂处理后30天内会导致油菜田土壤细菌多样性显著下降，其中甲草胺处理影响最大；但在除草剂处理60天后土壤中细菌群落多样性与丰富度有所回升。

Table 3 OTUs, richness and diversity index for bacterial communities from different soil-applied herbicide treatments

表3 经土壤封闭除草剂处理的油菜土壤细菌群落OTU、多样性和丰富度指数

处理 Treatment	OTU数目 OTU number	Chao1指数 Chao1 index	Shannon指数 Shannon index	Simpson指数 Simpson index
IS	6602	5113.6±681ab	10.35±0.19abc	0.9961±0.0007cde
CK30	4650	5057.69±233ab	10.27±0.05bc	0.9966±0.0002abcde
CK60	5078	5085.64±104ab	10.31±0.06bc	0.9963±0.0003bcde
AL30	3735	4340.61±253cd	10.21±0.12bcd	0.9971±0.0004abc
AL60	4933	5222.47±414a	10.26±0.25bc	0.9959±0.0012de
Y30	4480	4944.04±375abc	10.28±0.15bc	0.9968±0.0006abcd
Y60	5581	5450.57±140a	10.52±0.14a	0.9974±0.0010ab
AC30	4290	4594.94±74bcd	10.18±0.03cde	0.9966±0.0006abcde
AC60	4776	5521.80±248a	10.48±0.03ab	0.9976±0.0001a
M30	5084	4195.4±659d	10.01±0.18de	0.9956±0.0005e
M60	6456	5280.06±223a	10.43±0.05ab	0.9975±0.0001a

2.3 土壤封闭型除草剂对油菜土壤细菌群落组成和丰富度的影响

从11个土壤样本中共检测到49个细菌门，其中放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、厚壁菌门为优势菌门（图3），优势菌门在不同处理土样中的相对丰度在95.97%~97.31%之间。不同土壤封闭型除草剂处理30 d后，相对于同时期空白处理（CK30），放线菌门均有所减少，甲草胺、异丙甲草胺、乙草胺及精异丙甲草胺分别减少20.13%、9.46%、9.69%、17.4%；甲草胺处理中绿弯菌门和酸杆菌门增加最多分别为32.99%、18.44%。药剂处理60 d后，相对于同时期空白处理（CK60），甲草胺处理中放线菌增加6.68%，异丙甲草胺、乙草胺及精异丙甲草胺处理中放线菌减少5.94%、18.45%、15.4%；甲草胺、异丙甲草胺、乙草胺及精异丙甲草胺处理中酸杆菌分别减少11.66%，15.67%，0.13%，12.56%。说明土壤封闭型除草剂处理对油菜土壤中放线菌门、酸杆菌门等影响较大；在处理前期（30 d），甲草胺较其他除草剂处理中土壤细菌在门水平上变化最大。

Fig. 3 Relative abundances of bacteria at level of phylum in rapeseed field soil after treated with different soil-applied herbicides

图3 经土壤封闭除草剂处理的油菜田土壤细菌菌群在门水平上的相对丰度

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不同土壤封闭型除草剂处理后的土壤细菌优势属分析表明（图4），相对丰度排名前10的优势属包括鞘氨醇单胞菌属、Subgroup-6、马赛菌属、芽单胞菌属、溶杆菌属、KD4-96、类诺卡氏菌属、分枝杆菌属、沙壤土杆菌属和黄色土源菌属。处理30 d后，相对于同时期空白对照（CK30），鞘氨醇单胞菌属及Subgroup_6在甲草胺处理中变化最大，分别增加26.95%，23.75%；而甲草胺处理中马赛菌属、芽单胞菌属和类诺卡氏菌分别减少19.53%、21.53%、14.84%。处理60 d后，相对于同时期空白对照（CK60），甲草胺处理中鞘氨醇单胞菌属及Subgroup_6分别减少14.34%，12.14%；马赛菌属、芽单胞菌属和类诺卡氏菌分别增加52.53%，52.92%，1.62%。由此说明，不同土壤封闭型除草剂处理油菜田土壤后会对一些优势菌属的丰度造成显著影响，甲草胺较其他除草剂处理对土壤细菌菌属的影响最大；除草剂处理30 d时对鞘氨醇单胞菌、Subgroup-6、马赛菌属和牙单胞杆菌属影响最大，处理60 d时对马赛菌属、芽单胞菌属影响最大。

Fig. 4 Relative abundances of bacteria at level of genus in rapeseed field soil after treated with different soil-applied herbicides

图4 经土壤封闭除草剂处理的油菜田土壤细菌菌群在属水平上的相对丰度

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进一步根据Bray-curtis距离进行属水平的主成分分析，结果表明（图5），PC1、PC2对样本差异贡献率为58.2%、11.4%，不同时间处理的各类样本间差异显著，重复之间相似度高，说明处理后取样时间均对土壤细菌群落结构有显著影响，而药剂处理30 d和药剂处理60 d后的样本分别与同时期空白处理对照均无显著分离。通过NMDS分析发现（图6），初始土壤、30 d除草剂处理土壤、60 d除草剂处理土壤可被明显区分，说明取样时间对土壤微生物有显著影响。由此可知，除草剂处理后取样时间对土壤细菌群落的影响比除草剂种类更大（Stress=0.0874）。

Fig. 5 Principal component analysis （PCA） of bacteria in soil samples treated with different soil-applied herbicides

图5 不同土壤封闭型除草剂处理土壤细菌的PCA分析

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Fig. 6 Nonmetric Multidimensional scaling analysis （NMDS ） of bacteria in soil samples treated with different soil-applied herbicides

图6 不同土壤封闭型除草剂处理土壤细菌的NMDS分析

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2.4 土壤封闭型除草剂对油菜土壤主要功能细菌相对丰度的影响

油菜土壤经不同土壤封闭型除草剂处理后，对主要功能细菌的相对丰度分析发现（图7），油菜土壤中主要功能细菌包括鞘氨醇单胞菌属、马赛菌属、芽单胞菌属、Ramlibacter属、溶杆菌属、黄色土源菌属、新根瘤菌属、链霉菌属、黄色杆菌属等；其中鞘氨醇单胞菌属、马赛菌属与污染物降解有关，芽单胞菌属与反硝化相关，黄色杆菌属与土壤氮素转化有关，新根瘤菌属参与固氮，链霉菌属与吸收营养排泄代谢物、抑制病原菌生长有关，溶杆菌属可抑制病原菌生长，黄色土源菌属与根际促生有关，Ramlibacter属与光合作用相关。经土壤封闭型除草剂处理后，鞘氨醇单胞菌属、马赛菌属细菌丰度较空白处理升高，且在精异丙甲草胺处理土样中较高，处理30 d和60 d时分别高于空白对照37.3%、45.0%。除草剂处理30 d时在土壤中链霉菌属低于空白处理，60 d后与空白对照无差异。除草剂处理60 d后，新根瘤菌属显著高于空白处理，异丙甲草胺处理后最高且高于空白对照95.36% 。除草剂处理后芽单胞菌属、Ramlibacter属、溶杆菌属、黄色土源菌属的丰度较高。因此，土壤封闭型除草剂处理60 d后减少了与吸收营养排泄代谢物相关的功能细菌，但能不同程度增加与污染物降解、反硝化、光合作用、抑制病原菌生长、根际促生上有关功能细菌的丰度。

Fig. 7 Relative abundance of major functional bacteria in soil samples treated with different soil-applied herbicides

图7 不同土壤封闭型除草剂处理土壤主要功能细菌的相对丰度

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3 结论与讨论

土壤微生物在养分循环和能量流动等方面起着重要作用，有利于土壤腐殖质的分解、质量改善、养分循环和转化，从而促进植物生长^[15]。土壤微生物多样性和结构变化对植物的生长发育有着直接或间接影响^[16,17]。有关研究结果证明，除草剂剂量、土壤类型以及处理时间会对根际土壤微生物产生一定影响^[5]。本研究发现，土壤封闭型除草剂处理30 d后油菜田土壤微生物群落的结构及多样性会发生一定程度的改变，但60 d后这种变化又逐渐消失。前人研究中也有类似结果，使用草甘膦喷施小黑麦和豌豆田块后，经过15 d微生物的群落结构以及功能均会造成不同程度的变化，但达到30 d影响逐渐消失^[13]。使用推荐剂量的草铵膦和百草枯等除草剂处理香蕉土壤，土壤微生物的多样性及丰富度均无显著变化^[14]。乙草胺对玉米根际土壤中的细菌具有一定程度的抑制作用，抑制作用随施药时间的延长逐渐降低^[18]，该结论与油菜田土壤微生物变化趋势较为一致。但本研究显示封闭型除草剂处理30 d后土壤OTU数显著下降，丰富度也有一定下降，可能是由于不同种植模式下不同除草剂对土壤微生物群落结构以及多样性的影响有所差异。处理土壤封闭型除草剂后随着时间延长，油菜田土壤中的细菌群落多样性与丰富度有所回升，说明油菜田土壤微生物群落具有一定的自我修复能力。本文中NMDS分析结果表明，不同除草剂处理30 d和60 d，样本点距离较近，而所有除草剂处理在同一时间的样本点距离较远，进一步证实了除草剂处理后取样时间对土壤细菌群落的影响比除草剂种类更大这一假设。

除草剂对土壤中的功能细菌种类和结构会造成一定影响。已有研究发现，草甘膦处理后，板栗根际土壤细菌群落多样性无显著变化，但变形菌门、酸杆菌门中某些菌群的丰度产生变化，同时草甘膦对土壤微生物影响还与处理时间有关^[19]。同样地，本研究发现经过土壤封闭剂处理后，土壤中放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、厚壁菌门为优势菌门，药剂处理30天后，放线菌门减少、酸杆菌门增加。土壤微生物以群落的形式存在于土壤中，不仅是有机质和土壤养分转化的动力也影响土壤结构及肥力，从而影响植物生长。而变形菌、酸杆菌、子囊菌以及担子菌为土壤中的优势菌属，不同除草剂主要对这些优势菌属产生不同程度的抑制作用，使微生物多样性减少或者微生物群落结构和功能发生改变，破坏土壤生态系统的稳定性^[20]。本文发现，经过土壤封闭除草剂处理后，油菜田中与污染物降解、反硝化、光合作用、抑制病原菌生长、根际促生有关的功能细菌丰度有所升高。草甘膦处理也会增加具有抑制病原菌生长、增强植物抗旱性等功能外生真菌的丰度^[19]。土壤封闭型除草剂可能通过影响土壤中微生物菌群的结构从而对植物吸收营养正常生长造成直接或者间接的影响，但除草剂与土壤中功能细菌多样性变化之间的联系还有待进一步研究。

References

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1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 土壤封闭处理及取样
Table 1 Herbicide treatments and sampling times
1.2.2 土壤微生物基因组总DNA提取及PCR扩增
1.2.3 高通量测序数据处理
1.2.4 土壤微生物群落多样性分析
2 结果与分析
2.1 扩增子测序数据分析
Table 2 Quality control and preprocessing of high-throughput sequencing datasets
Fig. 1 Bacterial rarefaction curves of soil samples from rapeseed field
2.2 土壤封闭型除草剂对油菜土壤细菌群落α多样性的影响
Fig. 2 Venn diagrams showing numbers of shared and unique OTUs from different soil-applied herbicide treatments
Table 3 OTUs, richness and diversity index for bacterial communities from different soil-applied herbicide treatments
2.3 土壤封闭型除草剂对油菜土壤细菌群落组成和丰富度的影响
Fig. 3 Relative abundances of bacteria at level of phylum in rapeseed field soil after treated with different soil-applied herbicides
Fig. 4 Relative abundances of bacteria at level of genus in rapeseed field soil after treated with different soil-applied herbicides
Fig. 5 Principal component analysis （PCA） of bacteria in soil samples treated with different soil-applied herbicides
Fig. 6 Nonmetric Multidimensional scaling analysis （NMDS ） of bacteria in soil samples treated with different soil-applied herbicides
2.4 土壤封闭型除草剂对油菜土壤主要功能细菌相对丰度的影响
Fig. 7 Relative abundance of major functional bacteria in soil samples treated with different soil-applied herbicides
3 结论与讨论
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Received	Published
2022-10-18	2024-04-28
Issue Date
2024-04-28