Preparation and evaluation of acetamiprid quality control samples in rapeseed stalk

Yong-bo LAN; Chang-hong LIN; Pei-chun JIANG; Cong WU; Hui HUANG; Shu-ran XU; Shi-min CAI; Yong LIN; Yan-jie ZHENG

doi:10.19802/j.issn.1007-9084.2022296

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CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2024, Vol. 46 ›› Issue (2) : 437-442. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2022296

Preparation and evaluation of acetamiprid quality control samples in rapeseed stalk

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Abstract

In order to ensure the accuracy and reliability of the rapid determination of acetamiprid pesticide residues in rapeseed stalk, a method for the preparation of quality control samples was established and evaluated. The lyophilized quality control samples were prepared by matrix spiking and vacuum freeze-drying. And the determination of acetamiprid in the quality control samples was carried out by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The uniformity of the samples was assessed by random sampling and the stability of the samples was evaluated by observing the changes of acetamiprid over a period of one month. The quality control samples prepared by this method are homogeneous and stable, easy to store and transport, and suitable for rapid testing in the field of rapid test kit validation and blind sample assessment. This study established a simple process for the preparation of lyophilised powder quality control samples of rapeseed stalk, which provides a data reference for the study of common key technologies for the preparation of quality control samples of pesticide residues in vegetables.

Key words

acetamiprid / quality control samples / rapeseed stalk / freeze-dried vegetable powder

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Yong-bo LAN , Chang-hong LIN , Pei-chun JIANG , Cong WU , Hui HUANG , Shu-ran XU , Shi-min CAI , Yong LIN , Yan-jie ZHENG. Preparation and evaluation of acetamiprid quality control samples in rapeseed stalk[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2024, 46(2): 437-442 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2022296

啶虫脒是一种新型广谱的杀虫剂，具有较强的触杀和渗透作用，被广泛应用于蔬菜的病虫害防治。油菜是重要的油料作物，也是我国南方地区秋冬季的重要消费蔬菜之一^[1]。受气候、品种、土壤等因素的作用，油菜在种植过程中易遭受各类病虫害^[2]。近年来，由于高毒、高残留杀虫剂农药的禁用，啶虫脒等低毒农药被广泛用于油菜菜粉蝶和蚜虫的防治^[3]，啶虫脒等新烟碱类农药已逐渐成为目前世界上使用最广泛的杀虫剂之一^[4]。啶虫脒农药残留的问题也逐渐显现，因违规使用或滥用新烟碱类农药而引起的食品安全事件时有发生，对我国的环境和农产品安全造成较大的威胁。因此，对油菜薹中的啶虫脒农药残留进行快速、准确的检测对保障农产品质量安全具有重要的意义。

快速检测技术因快速、简便、灵敏度高、适合现场检测等优点，被广泛应用于蔬菜的快速筛查。但受快检人员、产品、设备、样品等因素影响，快速检测结果质量参差不齐。质控样品作为一种简易可行的质量保障措施，在确保检测结果的准确性及可溯源性方面发挥重要作用。蔬菜基质复杂，干扰因素多，如蔬菜中的色素、有机酸、维生素等次生物质会对蔬菜的快速检测结果产生干扰^[5]。与采用纯品标准物质进行质量控制相比，使用带基质的质控样品更能模拟快速检测过程中样品基质导致的干扰效应。因此，制备以实物为基质且均匀性和稳定性良好的质控样品对保障快速检测结果的准确性和可靠性具有重要意义。马维等^[6]对有机成茶喷施啶虫脒药液，阴干后，制成含啶虫脒残留的茶叶基体样品。刘燕等^[7]在空白豇豆冻干粉中添加啶虫脒标准溶液，再二次冻干制得均匀性和稳定性良好的豇豆质控样品。新鲜的蔬菜基质水分含量高、易腐烂、稳定性差。真空冷冻干燥技术可以进行低温脱水干燥的过程。采用真空冷冻干燥技术制备的蔬菜冻干粉质控样品能克服新鲜蔬菜基质的缺点，方便贮藏和运输。目前暂无对油菜薹中啶虫脒农药残留质控样品的制备技术研究。本研究以油菜薹为基质，采用真空冷冻干燥的技术手段，研究油菜薹中啶虫脒冻干粉质控样品的制备技术，并将质控样品用于人员考核和快检产品评价，以期为油菜薹中啶虫脒质控样品制备技术开发及在快速检测领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

啶虫脒标准品（99.6%，北京曼哈格生物科技有限公司）；乙腈、甲醇、丙酮（色谱纯、德国Merck公司）；N-丙基乙二胺（PSA）吸附剂（美国安捷伦科技有限公司）；氯化钠、乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；油菜薹（深圳市某大型超市），水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器

Thermo Scientific液质联用仪（美国Thermo公司）；Pilot7-12E真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；JXHG-32均质仪（上海净信实业发展有限公司）；EJM171食品加工机（粉碎机）（上海乐扣乐扣贸易有限公司）；H1850离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；BCM2500振荡仪（深圳逗点生物技术有限公司），Auto EVA-60氮吹仪（睿科集团（厦门）股份有限公司）。

1.3 质控样品的制备

本研究以油菜薹为基质，啶虫脒为目标物，分析冻干粉质控样品的研制程序。按照国家标准方法GB/T 23584-2009《水果、蔬菜中啶虫脒残留量的测定液相色谱-串联质谱法》^[8]对油菜薹中啶虫脒的含量进行检测，结果低于定量限，视为阴性，可作为空白基质样品制备质控样品。准确称取适量阴性油菜薹，使用粉碎机切成碎片。往油菜薹碎片中加入啶虫脒标准溶液（1.992 g/L）10 mL，混合均匀。将油菜薹碎片均匀平铺在冷冻盘中，放在冻干机中‒18℃预冻4 h，真空冷冻干燥80 h。将冷冻干燥后的基质样品用粉碎机打成粉末，过40目筛。冻干粉采用棕色玻璃瓶独立包装，6 g /瓶，密封冷藏（0-8℃）保存。

1.4 液相色谱-质谱法检测

1.4.1 样品前处理

取油菜薹冻干粉1 g，加水 9 g，涡旋混匀，加入20 mL乙腈，振荡30 min，加入5 g氯化钠，振荡10 min，9500 r/min离心4 min。取4 mL上清液至15 mL离心管，加入150 mg PSA，涡旋混合1 min，10 000 r/min离心5 min。取1 mL上清液氮吹至近干，加入1 mL 60%乙腈水，混匀后经微孔滤膜过滤，用于液相色谱-质谱仪测定。

1.4.2 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm×1.9 μm）；柱温：40℃；流速：0.3 mL/min；进样量：1 μL；流动相A：0.005 mol/L乙酸铵溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：0~0.001 min，90%A；0.001~1.5 min，90%~40%A；1.5~3 min，40%~10%A；3~5 min，10%A；5~5.1 min，10%~90%A。

1.4.3 质谱条件

电离方式：电喷雾电离，正离子；毛细管电压：3500 V；离子源温度：300˚C；鞘气压力：50 Arb；辅助气压力：10 Arb；扫描方式：多反应监测；啶虫脒的定性定量离子对及透镜电压、碰撞能量见表1。

Table 1 Qualitative and quantitative ion pairs, RF lens and collision energy of acetamiprid

表1 啶虫脒的定性定量离子对及透镜电压、碰撞能量

定性离子对

Qualitative ion pair /（m/z）

定量离子对

Quantitative ion pair /（m/z）

透镜电压

RF lens /V

碰撞能量

Collision energy /V

223＞126

105

33.1

223＞90

20.2

1.5 均匀性检验

在油菜薹冻干粉质控样品制备完成后当天，随机抽取10个分装后的样品进行均匀性检验，每个样品重复测定2次。参照CNAS-GL003:2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》^[9]，采用单因子方差分析法对样品的均匀性数据进行分析评估。若F＜显著性水平α=0.05，自由度为（9,10）的临界值F _0.05(9,10)，则表明样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。

1.6 稳定性检验

1.6.1 实验设计

室内稳定性：每隔10天随机抽取6个油菜薹质控样品进行啶虫脒含量测定，每个样品重复测试2次。

运输稳定性：随机抽取6个油菜薹质控样品，模拟质控样品实际应用场景：将质控样品和冰袋一起放于保温箱内，用快检车运输到50 km外的市场后又运回，用时2 h。对这6个质控样品进行啶虫脒含量测定，每个样品重复测试2次。

1.6.2 数据处理

参照CNAS-GL003:2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》^[9]，采用t检验法，考察每一次稳定性检验数据平均值与第0天检验平均值是否有显著性差异。若t＜显著性水平α=0.05，自由度10的临界值t _0.05(10)，则二个平均值之间无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 啶虫脒的色谱图、质谱图

本文使用电喷雾离子源（ESI）正离子多反应监测模式（MRM）对啶虫脒进行分析。图1为空白油菜薹样品中添加1 mg/kg啶虫脒的色谱图。图中可见啶虫脒色谱图峰形尖锐对称，在保留时间附近未出现明显的干扰峰，能够保证定量数据的准确。

Fig. 1 Mutiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of acetamiprid

图1 啶虫脒的MRM色谱图

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2.2 方法可靠性确认

选取经GB/T 23584-2009^[8]标准方法确证不含有啶虫脒的油菜薹作为空白基质，进行添加回收率实验。按照GB/T 27404《实验室质量控制规范食品理化检测》^[10]附录F：检测方法确认的技术要求，对于已制定最高残留限量的物质，回收率应在方法测定低限、最高残留限量、选一合适点进行三水平试验。油菜薹中啶虫脒最高残留限量为3 mg/kg^[11]。因此，选择方法检出限0.01 mg/kg^[8]，最高残留限量3 mg/kg以及油菜薹冻干粉复水后啶虫脒预计含量2 mg/kg作为本次回收率实验的加标浓度，结果见表2。本方法测定的啶虫脒添加回收率在92.3%~105.5%之间，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》^[10]检测方法确认的技术要求。方法添加回收率实验结果表明，本研究使用的液相色谱-质谱检测方法准确、可靠。

Table 2 Results of recovery experiments (n=6)

表2 添加回收率实验结果

浓度水平

Concentration level /（mg/kg）

回收率

Recovery /%

相对标准偏差

RSD /%

0.01

92.3~101.2

3.30

96.8~105.5

3.07

94.1~97.5

1.35

2.3 均匀性检验

均匀性检验结果和单因子方差分析结果见表3。实验测试的组间自由度为9，组内自由度为10。经统计分析，F值是0.801，小于临界值 F _0.05(9,10)=3.02，表明在0.05显著性水平时，油菜薹冻干质控样品中啶虫脒含量不存在显著性差异，添加的啶虫脒标准物质在冻干粉中的分布是均匀的。

Table 3 Homogeneity assessment results

表3 均匀性评估结果

样本 Samples	结果1 Results 1 /（mg/kg）	结果2 Results 2 /（mg/kg）	组内平均值 Intra group mean /（mg/kg）	总平均值 Total average /（mg/kg）
1	21.13	20.32	20.73	21.45
2	21.21	21.72	21.47
3	22.29	20.23	21.26
4	21.32	21.13	21.23
5	20.97	21.46	21.22
6	21.49	21.40	21.45
7	20.84	22.05	21.45
8	21.84	22.49	22.17
9	21.62	22.20	21.91
10	21.39	21.81	21.60
组间方差 Between-group variance	0.314
组内方差 Intra-group variance	0.392
F	0.801
F _{0.05（9，10）}	3.02

2.4 稳定性检验

2.4.1 室内稳定性

本研究打算将已制备的质控样品应用于一个月内食品快检人员的盲样考核，因此选择30天作为降解稳定的分析节点。考虑到食品快检场所的保存条件，选择在冷藏条件下开展稳定性评估。室内稳定性测定结果和数据分析结果见表4。经统计分析，第10、20、30天的t值均小于临界值t _0.05(10)=2.23，表明在冷藏条件保存下，在0.05显著性水平时，油菜薹质控样品中啶虫脒的含量未发生显著性变化，室内稳定性良好, 能满足实际应用需要。

Table 4 Interior stability assessment results

表4 室内稳定性评估结果

时间 Time /d	检验平均值 Inspection average value /（mg/kg）	标准偏差 Standard deviation	t	t _0.05（10）
0	21.22	0.266	/	2.23
10	21.44	0.824	0.618
20	21.68	0.477	2.088
30	21.01	0.086	1.795

2.4.2 运输稳定性

快检实施和快检质控样品应用的场所分散在各个街道各个市场，因此快检质控样品的稳定性还与样品运输过程中的外部因素有关。运输稳定性测定结果和数据分析结果见表5。经统计分析，t值是1.032，小于临界值t _0.05(10)=2.23，表明在经过约2 h的冷链运输后，在0.05显著性水平时，油菜薹质控样品中啶虫脒的含量未发生显著性变化，运输稳定性良好,能满足实际应用需要。

Table 5 Transport stability assessment results

表5 运输稳定性评估结果

时间

Time/day

检验平均值

Inspection average value/（mg/kg）

标准偏差

Standard deviation

t _0.05（10）

21.22

0.266

2.23

运输后

After transport

21.10

0.091

1.032

2.5 质控样品的快检应用

2.5.1 快检人员的盲样考核

将已制得的啶虫脒质控样品当做考核盲样，分发给深圳市9个快检室快检人员。使用时，取1 g啶虫脒冻干粉质控样品，加入6 g水，制成啶虫脒含量约3.06 mg/kg的模拟样品，使用啶虫脒胶体金免疫层析卡进行快检。结果显示，18份考核盲样的正确率为88.88%。考核未通过的人员另取油菜薹质控样品重新考核，检测过程注意充分振荡，最后初次考核未通过的人员均给出了正确的检测结果。快检人员评价油菜薹冻干质控样品没有腐烂变质情况，复水情况良好，形态接近实际样品。

2.5.2 快检产品评价

将已制得的啶虫脒质控样品当做测试样品，用于3个不同厂家的啶虫脒快检产品评价。使用时，取1 g啶虫脒冻干粉质控样品，加入6 g水，制成啶虫脒含量约3.06 mg/kg的阳性样品（1倍检出限）；取0.49 g啶虫脒冻干粉质控样品，加入6.51 g水，制成啶虫脒含量约1.50 mg/kg的阴性样品（0.5倍检出限）。每种快检产品使用12个阳性样品和12个阴性样品进行测试评价。结果表明，产品1和产品2的假阳性率和假阴性率均为0；产品3的假阴性率为0，假阳性率为100%，见表6。按照《食品快速检测方法评价技术规范》（食药监办科〔2017〕43号）^[12]要求，使用新鲜油菜薹加标阳性样品（1倍检出限）和新鲜油菜薹加标阴性样品（0.5倍检出限）对产品1-3进行评价，结果与使用油菜薹冻干粉质控样品的评价结果一致。快检产品应用情况表明，油菜薹冻干粉质控样品可作为新鲜油菜薹测试样品的替代，用于按照国家市场监督管理总局相关规定^[12]开展的快检产品评价工作。

Table 6 Evaluation results of rapid detection products

表6 快检产品评价结果表

样品情况 Sample information	产品1检测结果 Test results of product 1		产品2检测结果 Test results of product 2		产品3检测结果 Test results of product 3
样品情况 Sample information	阳性结果数 No. of positive results	阴性结果数 No.of negative results	阳性结果数 No. of positive results	阴性结果数 No.of negative results	阳性结果数 No. of positive results	阴性结果数 No.of negative results
阳性（1倍检出限） Positive （1× detection limit）	12	0	12	0	12	0
阴性（0.5倍检出限） Negative （0.5× detection limit）	0	12	0	12	12	0
假阴性率 /% False negative rate /%	0		0		0
假阳性率 /% False positive rate /%	0		0		100

3 讨论与结论

蔬菜基质复杂，农药残留水平低，研制以实物为基质，均匀性与稳定性好的质控样品对农药残留检测具有重要意义^[13]。本文采用真空冷冻干燥技术制备了油菜薹冻干粉质控样品，克服了农残易降解、实物样品不易保存等技术难题，建立了一种流程简单的油菜薹冻干粉质控样品制备方法，为蔬菜中农药残留质控样品制备共性关键技术研究提供了数据参考。通过对油菜薹中啶虫脒质控样品的均匀性、室内稳定性和运输稳定性的检验，证实已制备的质控样品均匀性和稳定性良好。本文制备的质控样品可应用于快检人员的盲样考核以及快检产品评价，并在检测过程质控，人员比对，仪器比对，机构监理、考核，快检方法开发、确认、比对等快速检测领域具有较好的应用前景。

References

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1 材料与方法
1.1 材料
1.2 仪器
1.3 质控样品的制备
1.4 液相色谱-质谱法检测
1.4.1 样品前处理
1.4.2 色谱条件
1.4.3 质谱条件
Table 1 Qualitative and quantitative ion pairs, RF lens and collision energy of acetamiprid
1.5 均匀性检验
1.6 稳定性检验
1.6.1 实验设计
1.6.2 数据处理
2 结果与分析
2.1 啶虫脒的色谱图、质谱图
Fig. 1 Mutiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of acetamiprid
2.2 方法可靠性确认
Table 2 Results of recovery experiments (n=6)
2.3 均匀性检验
Table 3 Homogeneity assessment results
2.4 稳定性检验
2.4.1 室内稳定性
Table 4 Interior stability assessment results
2.4.2 运输稳定性
Table 5 Transport stability assessment results
2.5 质控样品的快检应用
2.5.1 快检人员的盲样考核
2.5.2 快检产品评价
Table 6 Evaluation results of rapid detection products
3 讨论与结论
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2022-11-02	2024-04-28
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2024-04-28

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