Identification of resistance levels and preliminary investigation of resistance mechamism in sunflower varieties against Race G of <i>Orobanche cumana</i>

Ting-ting BAO; Sheng-hua SHI; Ning-ning YAN; Zhi-da LIU; Jia-le YANG; Wen-bing ZHANG; Jian ZHANG; Zhi-wei ZHANG; Jun ZHAO

doi:10.19802/j.issn.1007-9084.2023047

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CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2024, Vol. 46 ›› Issue (5) : 1129-1139. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2023047

Identification of resistance levels and preliminary investigation of resistance mechamism in sunflower varieties against Race G of Orobanche cumana

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Abstract

Orobanche cumana has become a bottleneck factor restricting the healthy development of the sunflower industry in China. Planting sunflower varieties resistant to broomrape is the simplest, feasible, and cost-effective control measure at present. It is important to clarify the mechanism of sunflower resistance for breeding resistant varieties to broomrape. In this study, we used the petri dish filter paper system to edaluate and identify the resistance level of 32 sunflower varieties. We selected two sunflower varieties (JK103 and LD5009) with significant difference in resistance and sensitivity level. After artificial inoculation of the G race, the differences in the number of parasitic nodulation on roots, callose deposition in cell wall, hydrogen peroxide accumulation, ROS scavenging enzyme activity and transcription expression of resistance genes between resistant and susceptible varieties were compared at germination stage, nodulation stage and shoot meristem stage. The results showed as follows: (1) The average number of parasitism tubercle in the roots of JK103 was 3.2, significantly lower than that of LD5009, which was 16.2. The callose mass deposited in the root cell wall of JK103 was significantly higher than that of LD5009; The content of hydrogen peroxide and the activities of different ROS scavenging enzymes in the roots of JK103 and LD5009 showed an initial trend of increase and then later decreased. The magnitude of the changes of the above indicators in the roots of JK103 was significantly higher than that of LD5009 at the same time point; The quantitative transcription level results of the resistance-related genes showed that, except XTH6, the relative expression content of all tested resistance-related genes, such as Ha-PR1, LOX, CAT, etc. in resistant variety JK103 was significantly higher than the susceptible variety LD5009. The above results suggested that sunflower against the infection of broomrape via structural and physiological resistance mechanism, meanwhile, the signal molecules, such as H₂O₂, JA and SA were also involved in the establishment of sunflower resistance upon the infection of broomrape.

Key words

Orobanche cumana / resistance gene / hydrogen peroxide content / antioxidant enzyme activity

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Ting-ting BAO , Sheng-hua SHI , Ning-ning YAN , Zhi-da LIU , Jia-le YANG , Wen-bing ZHANG , Jian ZHANG , Zhi-wei ZHANG , Jun ZHAO. Identification of resistance levels and preliminary investigation of resistance mechamism in sunflower varieties against Race G of Orobanche cumana[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2024, 46(5): 1129-1139 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2023047

向日葵（Heliauths annuus L.）是中国重要的油料作物之一，其栽培面积在油料作物中仅次于大豆、花生和油菜，是我国第四大油料作物^[1]。向日葵具有耐盐碱、耐瘠薄、抗干旱、适应性强等特点，在我国北方地区广泛种植。因向日葵种子的大量进口，使得列当（Orobanche cumana Wallr.）种子夹带在向日葵的种子中间进行远距离的传播，进而导致列当在我国向日葵产区的发生和危害日益严重，严重的影响我国向日葵产业的发展^[2]。列当在向日葵的整个生育期都可以寄生，向日葵被列当寄生后，植株生长缓慢、矮小，甚至干枯死亡。已发生向日葵列当且仍连年重茬种植向日葵的地块列当的发生尤为严重，寄生率能达到100%，导致向日葵几乎绝产，给农民和种植大户造成严重的经济损失^[3]。

向日葵列当作为一种全寄生的种子植物，由于叶片退化成鳞片导致自身无法进行光合作用，其生长所需的所有的营养和水分都需要通过与向日葵根系建立寄生关系，从向日葵植株的根系获得^{[4, 5]}。目前，防治向日葵列当的主要方法是和禾本科进行轮作、喷施化学除草剂、人工除草等^[6]。但是，由于向日葵列当的休眠期长、种子微小，传播途径广泛，上述防控措施的效果不佳。因此，研究向日葵抗列当机理对于向日葵的抗列当育种具有重要的意义。

植物在与病原菌的互作过程中，逐渐建立了一系列复杂的防御机制来抵御病原菌的入侵，除了皮层细胞壁加厚、胼胝质在寄主细胞壁沉积结构抗性外^[7]，还可以通过增加植物防御酶活性，形成植物保卫素等生理生化抗性以及调控抗性相关基因转录水平等分子机制来抵御病原菌的入侵。在各种有氧代谢的过程中，生物体内会伴随活性氧（reaction oxygen species, ROS）的产生。H₂O₂是最常见的活性氧信号分子，在响应外界生物与非生物胁迫反应中发挥着非常重要的作用，特别在调控植物抗性建立过程中必不可少^[8]，如烟草细胞中H₂O₂浓度的增加能够触发细胞的程序性死亡（hyersensitive response，HR）^[9]，H₂O₂作为活性氧组成中的一员，通过诱发HR反应，使得植物具有了抵抗病原菌侵染的第一道防线^[10]，但是，过量的H₂O₂产生和积累会损伤植物细胞自身的生物膜系统、酶系统和蛋白质，使植物处于氧化胁迫中^[11]。正常情况下，植物体内活性氧自由基的产生和消除处在一个动态平衡；当植物在受到逆境胁迫时，细胞内积累产生大量活性氧和自由基，此时，植物体内的ROS清除酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化物酶（peroxidase, POD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）的活性就会被激活，以此来消除活性氧自由基的大量积累对细胞造成的伤害。一般认为，当植物处在逆境胁迫，植物体内SOD、POD、CAT的活性越高，植株的抗氧化能力越强，二者呈现出显著的正相关关系^[12]。在向日葵与列当的互作过程中，还有一些编码病程相关蛋白、胼胝质合成酶以及调控H₂O₂路径的基因表达量也显著上调^[13]，如Mn-SOD、CAT基因；还有参与乙烯合成的ACCO1和涉及不同代谢途径（茉莉酸、水杨酸）的LOX及Ha-PR1等在列当侵染过程中显著被上调^[14]。

本研究利用本实验室建立的向日葵列当寄生的培养皿滤纸体系，对32份向日葵的抗列当G小种的水平进行了鉴定，从中筛选出抗（JK103）、感（LD5009）向日葵品种作为试验材料来初步简析向日葵的抗列当机制，为向日葵抗列当育种奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的向日葵材料为国家特色油料产业体系向日葵育种岗位和试验站以及一些育种企业提供的向日葵品种，共计32份。供试向日葵品种信息见表1。

Table 1 Information of tested sunflower varieties

表1 供试向日葵品种信息

序号 Serial No	品种名称 Variety name	来源 Variety source	序号 Serial No	品种名称 Variety name	来源 Variety source
1	LD5009	北京凯福瑞种业公司 Beijing Kefray Seed Company	17	ND907	内农大植物病理教研室 Department of Plant Pathology， Inner Mongolia Agricultural University
2	赤葵6003 Chukui6003	内蒙古赤峰市农牧科学院 Inner Mongolia Chifeng Academy of Agriculture and Animal Husbandry	18	科阳1号 Keyang 1	内蒙古农牧科学院 Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Husbandry
3	SH361	内蒙古三瑞种业有限责任公司 Inner Mongolia Sanrui Seed Industry Company	19	正和6号 Zhenghe 6	正和种业公司 Zhenghe Seed Company
4	ND903	内农大植物病理教研室 Department of Plant Pathology， Inner Mongolia Agricultural University	20	科阳7号 Keyang 7	内蒙古农牧科学院 Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Husbandry
5	LJ126	内蒙古巴彦淖尔市杭锦后旗 Inner Mongolia Bayannur City Hangjin Houqi	21	ZH9060	正和种业公司 Zhenghe Seed Company
6	ND901	内农大植物病理教研室 Department of Plant Pathology， Inner Mongolia Agricultural University	22	蒙裕6号 Mengyu 6	五原县蒙莎农业科技有限公司 Wuyuan County Monza Agricultural Technology Company
7	LSK18	黑龙江省农业科学院 Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences	23	JC337	金裕种业公司 Jinyu Seed Company
8	T33	内蒙古农牧科学院 Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Husbandry	24	ND905	内农大植物病理教研室 Department of Plant Pathology， Inner Mongolia Agricultural University
9	甘葵2号 Gankui 2	黑龙江甘南县向日葵研究所 Heilongjiang Gannan County Sunflower Research Institute	25	吉食葵2号 Jishikui 2	吉林省白城市农业科学院 Academy of Agricultural Sciences， Baicheng City， Jilin Province
10	ND906	内农大植物病理教研室 Department of Plant Pathology， Inner Mongolia Agricultural University	26	FA15C44	内农大植物病理教研室 Department of Plant Pathology， Inner Mongolia Agricultural University
11	JK108	吉林省白城市农业科学院 Academy of Agricultural Sciences， Baicheng City， Jilin Province	27	JK601	吉林省白城市农业科学院 Academy of Agricultural Sciences， Baicheng City， Jilin Province
12	科阳2号 Keyang 2	内蒙古农牧科学院 Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Husbandry	28	奥龙6号 Aolong 6	内蒙古奥隆种业有限责任公司 Inner Mongolia Aolong Seed Industry Company
13	LX336	国家向日葵产业技术体系 National Sunflower Industry Technology System	29	SH363	内蒙古三瑞种业有限责任公司 Inner Mongolia Sanrui Seed Industry Company
14	龙食葵5号 Longshikui 5	黑龙江省农业科学院 Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences	30	蒙莎301 Mengsha 301	五原县蒙莎农业科技有限公司 Wuyuan County Monza Agricultural Technology Company
15	ND902	内农大植物病理教研室 Department of Plant Pathology， Inner Mongolia Agricultural University	31	临葵4号 Linkui 4	山西省农业科学院 Shanxi Academy of Agricultural Sciences
16	HC3568	内农大植物病理教研室 Department of Plant Pathology， Inner Mongolia Agricultural University	32	JK103	吉林省白城市农业科学院 Academy of Agricultural Sciences， Baicheng City， Jilin Province

接种的向日葵列当种子采自呼和浩特市武川县哈乐镇大豆铺村（E:111°60′，N:41°16′）。通过单株纯化后，利用国际通用的列当鉴别寄主鉴定为G小种^[15]。

1.2 方法

1.2.1 向日葵品种抗列当水平的鉴定

向日葵种子的预处理：选取饱满的种子加入无菌水浸泡24 h后，用医用纱布将种子包裹，上方加盖湿润的毛巾，置于25℃恒温培养箱中进行催芽，每天早晚浸润种子两次，保持纱布和毛巾湿润。

列当种子的预处理：将向日葵列当种子过筛（80目）去除杂质，转入1.5 mL离心管。向离心管内加入1 mL无菌水振荡清洗， 12 000 r/min离心10 min，弃上清。向沉淀种子中加入75%乙醇溶液，振荡后静置5 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，重复该操作一次后向种子中加入无菌水冲洗3次。将种子平铺于无菌滤纸上干燥，干燥完成后毛笔收集于离心管中备用。

列当种子接种：在12×12 cm的塑料方皿的底部均匀平铺一层脱脂棉，用水浸湿润后，将列当种子均匀平铺在滤纸下方2/3处，将催芽的向日葵种子剥去种壳及种皮，接种到方皿中（2株/皿），并用少量湿润的脱脂棉压苗固定向日葵根系。盖上皿盖后用锡箔纸包裹塑料方皿进行避光处理，将培养皿竖直放置在光照培养箱中（温度25～28℃，相对空气湿度40%～60%，L//D=16 h//8 h），根据向日葵生长状况每2天浇1次水。

Table 2 Classification criteria for resistance to broomrape in sunflower (Petri dish filter paper method)^[16]

表2 向日葵抗列当水平标准划分（培养皿滤纸法）^[16]

抗病型 Disease resistant type	每皿向日葵上寄生列当瘤结数（X，个） Number of parasitic broomrape tubercles on sunflower per dish （X， pieces）
免疫Immunity （I）	X＝0
高抗High Resistance （HR）	0＜X≤5
中抗Mild Resistance （MR）	5＜X≤10
感病Susceptible （S）	10＜X≤15
高感High Susceptibility （HS）	15＜X

1.2.2 向日葵根系的取样

取样时间点设置：第1次取样在接种列当后第10天进行（10dpi，萌芽期）；第2次取样在接种列当后第25天，此时列当已经与向日葵根系建立寄生关系，形成瘤结（25dpi，瘤结期）；第3次取样为接种列当后第35天，此时列当瘤结膨大，开始形成假根，并且有茎尖的出现（35dpi，出茎期）。取样时，将向日葵的根系连同列当的瘤结一同取下，作为混合样本进行后续实验，每个处理设置5皿重复。

1.2.3 向日葵根系石蜡切片的制作

向日葵根系石蜡切片制作方法参考自蒲公英石蜡切片方法及宋阳徒手切片方法^{[17, 18]}。制好的切片使用OlyMPUS显微镜进行观察。

1.2.4 根系的胼胝质染色

在接种列当10dpi、25dpi、35dpi，分别取带有瘤结部分的抗、感向日葵的根系进行苯胺蓝染色。配置方法为将0.01g苯胺蓝溶于150 mmol/L K₂HPO₄中，配制为pH=9.5苯胺蓝染液。然后，将取得根系样本在染液中染色1～2h。然后，在荧光显微镜下进行观察、拍照。同时，利用对上述荧光照片在Image J软件中进行荧光强度的相对定量。

1.2.5 H₂O₂含量的测定

取新鲜的向日葵根系，用过氧化氢含量检测试剂盒（索莱宝公司，货号：BC3595）按照操作说明在415nm波长下测定根系的吸光度。每个样品重复3次。利用如下公式计算H₂O₂含量。

ΔA_测定=A_测定管－A_空白管

ΔA_标准=A_标准管－A_空白管

H₂O₂含量（μmol/g质量）=ΔA_测定÷（ΔA_标准÷C_标液）×V_样本÷（V_样本÷V_提取×W）

=2×ΔA_测定÷ΔA_标准÷W

1.2.6 ROS清除酶活性测定

按照1.2.1的处理方式，取样时间同1.2.2。SOD、POD、CAT提取及测定参照农业院校植物生理生化实验教材^[19]方法进行。每个试验3次重复。

1.2.7 抗性基因相对表达量的测定

使用北京金百特生物技术有限公司的RNAzol Reagent进行总RNA提取。总RNA通过NANO drop测定RNA质量（OD260/280数值在1.8~2.2之间）并定量至1μg/μL。使用北京金百特生物技术有限公司的Script III First Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录。

1.2.7.1 抗性相关基因引物信息

根据Li等^[20]和马立功等^[21]设计的向日葵抗病相关基因信息合成引物。引物信息如表3所示。

Table3 qRT-PCR primer information in sunflower

表3 向日葵qRT-PCR引物信息

基因名称 Gene name	功能 Function	PCR引物序列 PCR primer sequence	GenBank登录号 GenBank login number
EF-1α	延长因子（内参基因） Translation	GGATACAACCCCGACAAA	AY094064
EF-1α	延长因子（内参基因） Translation	CCTGAAGTGGGAGACGAA	AY094064
Mn-SOD	清除超氧自由基 Scavenging of superoxide radicals	TGAATGCTGAAGGTGCTG	DQ812552
Mn-SOD	清除超氧自由基 Scavenging of superoxide radicals	CCCAAACATCTATGCCAAT	DQ812552
CAT	乙醛糖体和过氧化氢酶 Glyoxysomal and peroxisomal enzyme	CGTCTTGGACCGAACTATT	L28740
CAT	乙醛糖体和过氧化氢酶 Glyoxysomal and peroxisomal enzyme	CAAACCACCCACAACTCTG	L28740
LOX	JA合成 JA synthesis	GTGTCATCACCGTCCAAC	AX146924
LOX	JA合成 JA synthesis	GCATAAGCCTTCACTGTCT	AX146924
ACCO1	乙烯合成 Ethylene synthesis	ACAGGGAGTTGATGAAGG	L29405
ACCO1	乙烯合成 Ethylene synthesis	ATGGTGGGTAGTTGCTAA	L29405
XTH6	细胞壁重建 Cell wall reconstruction	ACCCTTCTGCTGACTTCC	NC-035443
XTH6	细胞壁重建 Cell wall reconstruction	TCCTTTGGCTTCATTGTT	NC-035443
Sun-Loc	苯丙酸类合成 Phenylpropanoic acid synthesis	ACAGAATCTAGCCACACACTACCA	Y12461
Sun-Loc	苯丙酸类合成 Phenylpropanoic acid synthesis	GGGGTGATGTTGTTGTTGAGGAAT	Y12461
Ha-PR1	SA合成 SA synthesis	CTGGTGGACCTTATGGCGAG	KR071874
Ha-PR1	SA合成 SA synthesis	AGTGCACTGAACCCTAGCAC	KR071874

1.2.7.2 qRT-PCR反应

QRT-PCR检测选用莫纳生物公司的 SYBR^®Green qPCR Mix (Low ROX)进行。以EF-1α为内参基因，分别设置3个生物学重复以及3个技术重复。用2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量，并通过prism-8.1软件作图及方差分析。

2 结果与分析

2.1 向日葵品种抗列当G小种水平的鉴定

在室内条件下，利用培养皿滤纸体系对供试的32份向日葵品种根系上寄生的瘤结数进行了测定，结果如表4所示。根据表2的鉴定标准，列当在LD5009根系上寄生的平均瘤结数为16.2个，鉴定为高感品种；ND906、甘葵2号等10个品种的根系上寄生平均瘤结数介于10~15个之间，鉴定为感病品种；而SH363、奥龙6号以及JK601等19个品种的根系上寄生平均瘤结数介于5~10之间，鉴定为中抗品种；而蒙莎301、临葵4号和JK103根系上寄生的平均瘤结数分别为4.7、4.2和3.2，鉴定为高抗品种。基于上述鉴定结果，我们挑选出高抗品种JK103和高感品种LD5009用于后续的抗性机制的研究。

Table 4 Indoor resistance identification of sunflower varieties to broomrape

表4 向日葵品种抗列当水平室内抗性鉴定

序号 serial number	品种名称 Variety name	寄生瘤结数（个） Number of parasitic tubercles （individual）	抗性等级 Resistance grade	序号 serial number	品种名称 Variety name	寄生瘤结数（个） Number of parasitic tubercles （individual）	抗性等级 Resistance grade
1	LD5009	16.2	HS	17	ND907	8.3	MR
2	赤葵6003 Chikui 6003	14.4	S	18	科阳1号 Keyang 1	8.2	MR
3	SH361	14.0	S	19	正和6号 Zhenghe 6	7.7	MR
4	ND903	12.8	S	20	科阳7号 Keyang 7	7.0	MR
5	LJ126	12.7	S	21	ZH9060	6.4	MR
6	ND901	12.6	S	22	蒙裕6号 Mengyu 6	6.1	MR
7	LSK18	12.0	S	23	JC337	6.1	MR
8	T33	11.7	S	24	ND905	6.1	MR
9	甘葵2号 Gankui 2	11.7	S	25	吉食葵2号 Jishikui 2	5.9	MR
10	ND906	10.5	S	26	FA15C44	5.7	MR
11	JK108	9.4	S	27	JK601	5.5	MR
12	科阳2号 Keyang 2	9.1	MR	28	奥龙6号 Aolong 6	5.3	MR
13	LX336	8.8	MR	29	SH363	5.3	MR
14	龙食葵5号 Longshikui 5	8.6	MR	30	蒙莎301 Mengsha 301	4.7	HR
15	ND902	8.6	MR	31	临葵4号 Linkui 4	4.2	HR
16	HC3568	8.3	MR	32	JK103	3.2	HR

2.2 抗、感品种列当寄生后根系石蜡切片观察

在列当的寄生不同阶段，利用番红固绿染色法，对JK103和LD5009向日葵品种根系列当的侵染过程进行了观察，结果如图1所示。由图1可以看到在列当寄生的不同时期，在抗性品种JK103根系表皮细胞与列当接触的部位有大量新的细胞形成，且细胞壁变厚（图1A-F）。感列当品种LD5009根系中没有观察到在接触位置皮层细胞大量增加，胞壁变厚的现象，且列当组织已经侵入到向日葵根部维管束中（图1G-L）。

Fig. 1 Tissue section of resistant and susceptible sunflower root system after infection

Note: A-F: paraffin sections of the root cross section of susceptible variety LD5009, in which Figures B, D and F is the multiple enlargement of Figures A, C and E respectively; G-L: paraffin sections of the root cross section of resistant variety JK103, in which H, J and L is the magnified multiple of Figures G, I and K; Figures A, B, G and H show the stage of small parasitic turbercles; Figure C, D, I, J show the stage of parasitic large turbercles; Fig. E, F, K, show the young stem stage of the column. sr: sunflower root; bt: broomrape tubercles

图1 列当侵染抗、感向日葵根系后的石蜡切片

注：A-F：感列当品种LD5009根部横截面石蜡切片，其中图B、D、F分别为图A、C、E的倍数放大图；G-L：抗列当品种JK103根部横截面石蜡切片，其中图H、J、L分别为图G、I、K的倍数放大图；图A、B、G、H为列当寄生小瘤结期，图C、D、I、J为列当寄生大瘤结期，图E、F、K、L为列当幼茎期；sr：向日葵根系；bt：列当瘤结

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2.3 抗、感品种寄生后列当根系中胼胝质的沉积

在列当接种抗、感向日葵品种后的不同时间点取样后进行苯胺蓝染色，结果如图2所示。在列当的不同寄生阶段，抗、感品种根系中胼胝质沉积有一定变化，具体表现为在列当萌芽期时，感列当品种LD5009的瘤结（红色五角星标注）附近胼胝质的沉积数量明显少于抗列当品种JK103；在列当瘤结期时，抗列当品种及感列当品种瘤结寄生根系出均有胼胝质的大量积累，且两个抗性水平不同的向日葵品种根系中胼胝质的沉积量均显著高于列当萌芽期，但抗列当品种根系中沉积量大于感列当品种；列当出茎期时，抗列当品种根系中胼胝质沉积量明显的高于感列当品种（如图2）。列当寄生后，向日葵根系细胞壁上胼胝质荧光强度的量化结果如图3所示。列当萌芽期时，抗病品种JK103与感病品种LD5009相比，荧光值增加了10.13；在列当瘤结期时，与列当萌芽期相比JK103根系胼胝质沉积量的荧光值增加了8.36，而感病品种荧光值增加了8.55，但增加幅度的差异不显著；但是JK103与LD5009相比，荧光值增加了9.94；在列当出茎期时，胼胝质的荧光强度与列当瘤结期相比略有下降，抗、感向日葵品种根系中胼胝质沉积量分别下降了5.15及2.02。

Fig. 2 Callose deposition on cell wall of resistant and susceptible sunflower roots inoculated with broomrape

图2 抗、感向日葵根系接种列当后细胞壁上胼胝质的沉积

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Fig. 3 Changes of fluorescence intensity of callose deposition in roots of resistant and susceptible varieties of sunflower after infection broomrape

图3 抗、感品种列当侵染后根系中胼胝质沉积量的荧光强度的变化

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整体来看，抗病品种JK103根系中胼胝质的沉积量在列当寄生的不同阶段均高于感病品种LD5009，抗感品种间存在显著性差异，且在列当瘤结形成期细胞壁中胼胝质沉积量达到峰值。

2.4 抗、感品种列当寄生后根系中H₂O₂水平和ROS清除酶活性的变化

列当寄生后抗、感向日葵品种根系中H₂O₂积累量的检测结果如图4A所示。整体来看，不论是抗病还是感病的品种，列当接种后向日葵根系中的H₂O₂水平呈现出先增加后降低的趋势，且在列当寄生的瘤结期达到最大值。但是如果对相同时间点抗、感品种根系中的H₂O₂含量进行比较，发现在列当寄生的萌芽期、瘤结期和出茎期抗列当品种中H₂O₂浓度比感病品种分别增加了172.80%、38.18%和61.06%，二者差异呈现极显著水平。

列当寄生后向日葵根系中H₂O₂大量积累促使我们对ROS清除酶如SOD，POD和CAT的活性进行了测定，结果如下：

超氧化物歧化酶（SOD）：整体来看，接种列当后抗、感向日葵根系中SOD酶的活性呈现先升高后降低的趋势，且在列当瘤结期SOD的酶活性达到峰值。如果比较相同时间点SOD的活性，抗列当品种JK103中SOD的酶活性在瘤结期和出茎期比感病品种分别增加了40.35%和54.99%，均显著高于感列当品种LD5009（图4B）。

过氧化物酶（POD）：接种列当均促使抗、感向日葵根系中POD活性呈现先升高后降低的趋势，且在列当瘤结期产生过氧化物酶活性达到峰值。同样，相同时间点下，抗列当品种JK103中过POD的活性在瘤结期显著高于感列当向日葵LD5009, 增幅为40.67%；但是在列当的萌芽期和出茎期，抗、感品种POD的活性没有显著差异（图4C）。

过氧化氢酶（CAT）：接种列当后抗、感向日葵根系中CAT酶活性呈现先升高后降低的趋势；且在列当寄生的瘤结期和出茎期，抗列当品种JK103中CAT酶活性显著高于感列当品种LD5009，酶活性的增幅分别为29.84%和66.65%。但在列当种子萌芽期，CAT在抗、感品种间没有显著的差异（图4D）。

Fig. 4 Accumulation of hydrogen peroxide in root cells of sunflower plants inoculated broomrape

Note: 1: A: Hydrogen peroxide content; B: SOD enzyme activity; C: POD enzyme activity; D: CAT enzyme activity

图4 抗、感向日葵品种列当侵染后根系细胞中H₂O₂的积累和ROS清除酶活性的变化

注：A：过氧化氢含量；B：SOD酶活性；C：POD酶活性；D:CAT酶活性

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2.5 抗、感品种列当寄生后根系中抗性相关基因转录水平的变化

为了探究列当寄生对抗、感品种中抗性相关基因转录水平的影响，本研究挑选了7个与H₂O₂形成、茉莉酸、水杨酸及乙烯信号路径有关的抗病相关基因，并检测了上述基因在接种前后转录水平的变化，结果表明（图5），在抗病品种中，除XTH6外，其他6个候选基因的表达量均呈现先升高后下降的趋势；在感病品种中，除Mn-SOD和CAT外，其余5个基因的表达量也呈现先升高后降低的趋势，但是同一时间点内，抗性品种的上述抗性基因的表达量均显著高于感病品种。

列当萌芽期，抗病品种根系中和H₂O₂形成相关基因Mn-SOD和CAT的相对表达量相比感病品种分别提高了7.92倍和0.82倍；而和SA、JA以及乙烯路径相关的Ha-PR1、LOX、SunLoc以及ACCO1基因的相对表达量也提高了2.84倍、1.83、1.57和 3.44倍；和细胞壁重建有关的基因XTH6的表达量也增加了79.24倍。

列当瘤结期，与感病品种相比较，抗病品种根系中和H₂O₂形成相关基因Mn-SOD和CAT的相对表达量相比感病品种分别提高了24.91倍和24.46倍；而和SA以及乙烯路径相关的Ha-PR1和ACCO1基因的相对表达量也提高了4.34和7.06倍；和细胞壁重建有关的基因XTH6在列当的这一发育时期的表达量变化不显著，仅仅增加了0.85倍。而和JA合成相关基因LOX和SunLoc下调表达，但下调幅度较小，仅仅下调感病品种的7%和5%。

列当出茎期，与感病品种相比较，抗病品种根系中和H₂O₂形成相关基因Mn-SOD 和CAT 的相对表达量相比感病品种分别提高了15.71倍和23.41倍；而和SA路径相关基因表达量上调了7.51倍；而和JA以及乙烯路径相关的基因LOX、SunLoc和ACCO1基因的相对表达量也提高了4.34和7.06倍；和细胞壁重建有关的基因XTH6在列当的这一发育时期的表达量变化不显著，仅仅增加了0.85倍。而和JA合成相关基因LOX和SunLoc上调的幅度非常的低。而和细胞重建有关的XTH6的基因的表达量增加的幅度较小，仅仅是感病品种的1.80倍。

Fig. 5 Effects of different cultivars inoculated with broomrape on the expression of disease resistance related genes in sunflower

图5 抗、感向日葵品种列当侵染后抗病相关基因表达量的影响

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3 讨论与结论

内蒙古自治区及新疆维吾尔自治区是我国向日葵的主要种植区，种植总面积占全国向日葵种植面积68%以上，产量更是占据全国向日葵总产量70%以上^[22]。然而，随着向日葵种植面积的不断扩大，向日葵列当也逐步发展成为向日葵生产的最大威胁，严重时可造成80%以上的产量损失^[23]。选用抗病品种是最为经济有效的防治列当的手段，而目前对抗病品种的抗性机制研究相对较少。

相对于田间抗性鉴定、盆栽抗性鉴定等方法，室内条件下的培养皿滤纸法具有省时省力、易于取样等优点。石胜华^[24]等人通过对田间抗性鉴定结果与室内培养皿滤纸体系的抗性鉴定结果对比，证明了培养皿滤纸法抗性鉴定的准确性。在侵染过程中，列当是否能够在抗、感向日葵品种根系形成吸器，即列当侵染部分是否能够和寄主根系的维管束组织建立一定的连接关系对列当的成功寄生至关重要^[25]。本研究利用组织切片观察到，发现抗性品种的根部与列当接触部位的皮层细胞大量增加，且胞壁变厚，而感病品种同时期根部已经被向日葵列当侵入并与维管束系统融合在一起。因此抗病品种延缓或阻止列当与向日葵维管束的连接，导致抗性品种根系上寄生瘤结数量少，而感病品种由于不能抑制列当的入侵，所以在根系上寄生了较多的瘤结。

植物韧皮部细胞壁中胼胝质的沉积能降低筛管和胞间连丝的通透性，提高寄主植物对寄生性植物的抗性^[26]。赵思阳^[27]通过对大豆不同品种中胼胝质的沉积研究发现，胼胝质在抗病品种中大量沉积，而在感病品种中沉积很少，胼胝质的沉积量与不同品种的抗虫性呈正相关。本研究同样发现，在向日葵根系中胼胝质沉积量在抗病品种中多于感病品种，预示着列当的侵染能够促使细胞壁中胼胝质沉积，进而加固或强化结构抗性来抵抗列当的入侵。

SOD、POD、CAT的协同作用组成了植物防御系统中的一个抗氧化链条^[28]。SOD为超氧自由基清除剂，可以清除植物细胞内·O₂ ^-，是植物体内清除活性氧的第一道防线^[29]。CAT在植物体内可以将SOD的歧化产物H₂O₂分解成H₂O，从而达到清除体内多余H₂O₂的目的，避免了H₂O₂对植物组织的伤害^[30]。POD能清除体内多余的H₂O₂，保护植物细胞，增强植物的抗逆性^[31]。本研究中列当入侵后抗氧化酶的活性与张默靖^[6]、李霞^[32]等研究结果一致研究结果一致，在接种向日葵列当后，随接种时间的延长，向日葵根系内SOD、POD、CAT活性均呈现先升高后降低的趋势，抗病品种JK103的抗氧化酶活性变化趋势显著高于感病品种LD5009，主要是由于向日葵在轻度胁迫下，通过增加抗氧化酶活性来维持细胞内活性氧的动态平衡，但随着寄生程度严重后，过度胁迫使抗氧化酶活性下降。宋培玲等将油菜黑胫病菌接种至不同抗性水平的油菜中发现，抗感品种中PPO、POD、PAL、CAT和SOD等5中防御酶活性显著升高，且抗病品种中防御没活性远远高于感病品种^[33]。

张金花等人同样发现，以马铃薯糖苷生物碱处理枸杞后，PPO、POD、PAL和SOD 4种与抗性相关酶的活性均有不同程度的提高，且随着诱导时间的延长，处理组的酶活性均表现为先上升后下降的趋势^[34]。列当寄生植株后，诱导植株产生全面、系统的抗病反应，这种抗病性的产生涉及组织形态学和生理生化等方面的变化，从而提高植株的抗病能力。

水杨酸和茉莉酸在诱导植物自身防御反应中发挥着重要作用^[35]。本研究通过qRT-PCR分析了多个与过氧化氢产生、水杨酸、茉莉酸和乙烯信号路径相关基因的表达量。所检测的七个抗病基因在向日葵列当寄生抗、感列当向日葵品种后表达量均呈上升的趋势，而且抗病品种中这些基因显著高于感病品种。Li^[19,20]等人施用5-氨基乙酰丙酸（ALA）增加了向日葵对列当的抗性，同样使得JA生物合成途径的LOX、乙烯合成的相关基因HACS.1和ACCO1表达量上调。由于抗列当向日葵品种中Mn-SOD、CAT、Ha-PR1、ACCO1基因上调幅度大于感列当品种，激活了过氧化氢、水杨酸和乙烯通路，诱导向日葵对于列当抗性的建立，因此表现为抗病的特性。

References

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1 材料与方法
1.1 材料
Table 1 Information of tested sunflower varieties
1.2 方法
1.2.1 向日葵品种抗列当水平的鉴定
Table 2 Classification criteria for resistance to broomrape in sunflower (Petri dish filter paper method) [16]
1.2.2 向日葵根系的取样
1.2.3 向日葵根系石蜡切片的制作
1.2.4 根系的胼胝质染色
1.2.5 H2O2含量的测定
1.2.6 ROS清除酶活性测定
1.2.7 抗性基因相对表达量的测定
1.2.7.1 抗性相关基因引物信息
Table3 qRT-PCR primer information in sunflower
1.2.7.2 qRT-PCR反应
2 结果与分析
2.1 向日葵品种抗列当G小种水平的鉴定
Table 4 Indoor resistance identification of sunflower varieties to broomrape
2.2 抗、感品种列当寄生后根系石蜡切片观察
Fig. 1 Tissue section of resistant and susceptible sunflower root system after infection
2.3 抗、感品种寄生后列当根系中胼胝质的沉积
Fig. 2 Callose deposition on cell wall of resistant and susceptible sunflower roots inoculated with broomrape
Fig. 3 Changes of fluorescence intensity of callose deposition in roots of resistant and susceptible varieties of sunflower after infection broomrape
2.4 抗、感品种列当寄生后根系中H2O2水平和ROS清除酶活性的变化
Fig. 4 Accumulation of hydrogen peroxide in root cells of sunflower plants inoculated broomrape
2.5 抗、感品种列当寄生后根系中抗性相关基因转录水平的变化
Fig. 5 Effects of different cultivars inoculated with broomrape on the expression of disease resistance related genes in sunflower
3 讨论与结论
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Received	Published
2023-03-03	2024-10-28
Issue Date
2024-10-28

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1 材料与方法

1.1 材料

Table 1 Information of tested sunflower varieties

1.2 方法

1.2.1 向日葵品种抗列当水平的鉴定

Table 2 Classification criteria for resistance to broomrape in sunflower (Petri dish filter paper method) [16]

1.2.2 向日葵根系的取样

1.2.3 向日葵根系石蜡切片的制作

1.2.4 根系的胼胝质染色

1.2.5 H2O2含量的测定

1.2.6 ROS清除酶活性测定

1.2.7 抗性基因相对表达量的测定

1.2.7.1 抗性相关基因引物信息

Table3 qRT-PCR primer information in sunflower

1.2.7.2 qRT-PCR反应

2 结果与分析

2.1 向日葵品种抗列当G小种水平的鉴定

Table 4 Indoor resistance identification of sunflower varieties to broomrape

2.2 抗、感品种列当寄生后根系石蜡切片观察

Fig. 1 Tissue section of resistant and susceptible sunflower root system after infection

2.3 抗、感品种寄生后列当根系中胼胝质的沉积

Fig. 2 Callose deposition on cell wall of resistant and susceptible sunflower roots inoculated with broomrape

Fig. 3 Changes of fluorescence intensity of callose deposition in roots of resistant and susceptible varieties of sunflower after infection broomrape

2.4 抗、感品种列当寄生后根系中H2O2水平和ROS清除酶活性的变化

Fig. 4 Accumulation of hydrogen peroxide in root cells of sunflower plants inoculated broomrape

2.5 抗、感品种列当寄生后根系中抗性相关基因转录水平的变化

Fig. 5 Effects of different cultivars inoculated with broomrape on the expression of disease resistance related genes in sunflower

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1.2.5 H₂O₂含量的测定

2.4 抗、感品种列当寄生后根系中H₂O₂水平和ROS清除酶活性的变化