Regulation of shoot branching by <i>BnaFZP</i> in <i>Brassica napus</i> based on gene editing technology

Qian-qian LIU; Xiao-xiao SHEN; Huai-lin LI; Kai-di YU; Chu-chuan FAN

doi:10.19802/j.issn.1007-9084.2023070

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CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2024, Vol. 46 ›› Issue (5) : 985-992. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2023070

Regulation of shoot branching by BnaFZP in Brassica napus based on gene editing technology

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Abstract

The FRIZZYPANICLE ( FZP) gene encodes the AP2/ERF transcription factor and is involved in plant architecture (shoot branching) regulation in the model plant Arabidopsis thaliana, which is an important target gene for the improvement of plant architecture in rapeseed. In the present study, we assessed the functions of rapeseed homologues of FZP gene in rapeseed at first time. According to the rapeseed bioinformatics analysis and gene cloning, we identified six copies of BnaFZP in Brassica napus genome. There is only an exon for all copies, which contains a conserved AP2-domain at N-terminal of their proteins. Gene expression analysis revealed that the BnaFZP expression levels were very low in different tissues, with a relative higher expression in roots, petals and siliques. A total of 48 targeted mutants with loss-of-function alleles at different copies of BnaFZP gene were obtained at T₀ generation using the CRISPR/Cas9 system and Agrobacterium-mediated transformation. The induced mutations were stably transmitted to successive generations, and a variety of BnaFZP homozygous T-DNA-free mutants were obtained in the T₁ generation. Phenotypic observation of the obtained mutants showed that the homozygous BnaA02g35090D / BnaC02g08170D double mutants and homozygous BnaC03g09100D / BnaA02g35090D / BnaC02g08170D triple mutants presented significant much shoot branching, which indicted that BnaFZP is involved in the regulation of plant architecture. Collectively, the mutants generated in this study would provide valuable resources for both basic studies and breeding programs.

Key words

Brassica napus L. / BnaFZP / AP2/ERF / CRISPR/Cas9 / plant architecture

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Qian-qian LIU , Xiao-xiao SHEN , Huai-lin LI , Kai-di YU , Chu-chuan FAN. Regulation of shoot branching by BnaFZP in Brassica napus based on gene editing technology[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2024, 46(5): 985-992 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2023070

油菜（ Brassica napus L.）是我国第五大作物、第一大油料作物，常年种植面积800万公顷，年生产“最健康的大宗食用植物油”菜籽油500多万吨，约占自产食用植物油的55%，另可提供800多万吨饲料饼粕；油菜还可用作蔬菜、饲料、绿肥、观赏与蜜源等，是农村三产结合最好的大田作物，也是藏粮于地、农牧结合、脱贫攻坚、建设美丽乡村的重要作物 ^{[ 1]}。

油菜单株产量由单株有效角果数、每角果粒数和千粒重三大产量因素构成 ^{[ 2]}。植株株型如株高、分枝数、叶型、分枝位置等，也对油菜产量产生重要影响 ^{[ 3- 6]}。油菜分枝属于数量性状，不仅受遗传因子调控，还极大地受环境的影响。目前生产上的油菜品种分枝一般为8~9个，有些特殊材料的分枝可达20多个 ^{[ 7]}。因此，通过优化株型、提高有效分枝数，对油菜单产提高具有很大的潜力。目前对油菜株型性状的调控机理研究还较少，缺乏可以有效利用的株型基因资源。

FRIZZY PANICLE （ FZP）是禾本科植物中控制小穗分化和发育的重要基因，可防止腋芽分生组织的形成，与作物产量密切相关 ^{[ 8]}。 FZP编码AP2/ERF转录因子超家族中的RRF亚家族B-1 （也称VIIIb）成员。该类转录因子含有一个由60个左右的氨基酸所构成的AP2/ ERF结构域 ^{[ 9]}。在近30种禾本科植物中 FZP同源基因保守结构域分析表明，AP2/ERF结构域高度保守，几乎没有氨基酸的自然变异 ^{[ 8]}。目前， FZP同源基因在玉米（ ZmBD1）、水稻（ OsFZP）和小麦（ WFZP）等禾本科作物中的突变体开展了较为深入的基因功能研究。在水稻中， fzp突变体表现为小穗分化受阻，形成一团枝梗，不能发育正常的花器官和正常结实 ^{[ 10]}；玉米的 bd1突变体，初始小穗转化为不确定的分枝 ^{[ 11]}；小麦中 wfzp-d突变体表现多穗表型 ^{[ 12]}。 FZP在拟南芥中的同源基因是 PUCHI，参与调控花序分生组织特性、花器官发育、苞叶抑制和侧根发育。 puchi突变体表现为部分的花转变成花序即分枝，但不影响花器官的特性 ^{[ 13]}。 PUCHI调控花序建成的功能与上游基因 BLADE-ON-PETIOLE1 ( BOP1)和 BOP2重叠， puchi bop1 bop2的三重突变体显示出大量次生花序，比任何一个亲本突变体都要多六至七倍。此外， PUCHI连同作用 BOP1和 BOP2促进两个花分生组织特性调节因子 LEAFY和 APETALA1的表达 ^{[ 14]}。在VIIIb组转录因子中， PUCHI与 DRNL及其旁系同源基因 DORNRÖSCHEN( DRN)密切相关 ^{[ 15]}。研究表明， drnl功能缺失仅影响雄蕊发育 ^{[ 16, 17]}。 Drn突变体具有抑制顶端分生组织发育的功能 ^{[ 18, 19]}。 puchi drn drnl的三重突变体功能冗余调控花分生组织特性， puchi drn drnl bop1 bop2的五重突变体中，FMs完全转化为侧生分生组织，表明这五个基因组合定义了一个调节FM特性的基因调控网络 ^{[ 20]}。综上所述， FZP及其同源基因在调控花序分生组织特性中具有一定的功能保守性，也有各自调控发育的特异性。 FZP突变体在拟南芥中的表型要比玉米或水稻中的同源基因突变表型微弱的多；这可能是因为拟南芥中该基因与其它基因存在部分功能冗余所致。此外，拟南芥的 PUCHI还通过介导生长素信号转导，影响侧根发育 ^{[ 21- 23]}。

基于转录因子 FZP在植物中具有调控分枝的功能，本研究首次针对油菜中的同源基因 BnaFZP开展了功能研究，并利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行靶向突变，解析该基因参与分枝调控的功能，为甘蓝型油菜株型与分枝调控的分子机理研究与株型改良提供了重要研究材料。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用的遗传转化受体材料为半冬性甘蓝型油菜品系甲9707（J9707），由华中农业大学周永明教授提供。遗传转化获得的再生苗及其后代材料的种植均在华中农业大学转基因基地试验田中进行。

1.2 方法

1.2.1 基因的克隆及序列分析

在拟南芥TAIR数据库下载同源基因的DNA、CDS和蛋白质序列；在NCBI （ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库和芸薹属数据库（ http://brassicadb.org/）进行Blast分析，获得靶基因在甘蓝型油菜Darmor参考基因组中的同源拷贝序列，并利用重测序数据获取J9707中的基因序列。利用IDT的在线工具PrimerQuest Tool设计克隆引物，引物序列详见附表1（见首页OSID码）。

**Table 1 Genotypic analysis of BnaFZP mutants and their transmission from T₀ to T₁ generations**

表1 T₀到T₁代 BnaFZP突变体基因型分析

植株编号	世代	BnaA03g07180D	BnaC03g09100D		BnaA10g26790D	BnaC09g39250D	BnaA02g35090D	BnaC02g08170D
Plant ID	Generation	S2	S2	S3	S2	S2	S2	S2
PSH48-5	T₀	wt	Hetero	wt	wt	wt	Hetero	wt
PSH 48-5-1	T₁	wt	wt	wt	wt	wt	Homo	wt
PSH 48-5-3	T₁	Homo	Homo	wt	wt	Hetero	Hetero	Hetero
PSH 48-5-6	T₁	wt	Hetero	wt	wt	wt	Hetero	wt
PSH 48-6	T₀	Homo	Homo	Homo	Hetero	Hetero	Hetero	Hetero
PSH 48-6-1	T₁	Homo	Homo	Homo	Homo	Hetero	Homo	Homo
PSH 48-6-5	T₁	Homo	Homo	Hetero	Homo	wt	Hetero	Hetero
PSH 48-6-10	T₁	Homo	wt	wt	Hetero	wt	Hetero	Hetero
PSH 48-7	T₀	Hetero	Homo	wt	wt	Hetero	wt	Homo
PSH 48-7-1	T₁	wt	Homo	wt	wt	wt	wt	Homo
PSH 48-7-2	T₁	Hetero	Homo	wt	wt	Homo	wt	Homo
PSH 48-7-6	T₁	Homo	Homo	wt	Hetero	Homo	wt	Homo
PSH 48-9	T₀	wt	Hetero	wt	wt	wt	Hetero	Homo
PSH 48-9-1	T₁	wt	Hetero	wt	wt	wt	Hetero	Homo
PSH 48-9-4	T₁	wt	Homo	wt	wt	wt	Hetero	Homo
PSH 48-9-11	T₁	wt	Homo	wt	wt	wt	Homo	Homo
PSH 48-11	T₀	Homo	Homo	wt	Hetero	Hetero	Hetero	Homo
PSH 48-11-1	T₁	Homo	Homo	wt	Hetero	Homo	Hetero	Homo
PSH 48-11-3	T₁	Homo	Homo	wt	Homo	wt	wt	Homo
PSH 48-11-7	T₁	Homo	Homo	wt	Hetero	wt	Homo	Homo
PSH 48-11-8	T₁	Homo	Homo	wt	Homo	Hetero	Homo	Homo
PSH 48-13	T₀	Hetero	Hetero	wt	wt	wt	Hetero	Homo
PSH 48-13-1	T₁	wt	Homo	wt	wt	wt	Homo	Homo
PSH48-57	T₀	Hetero	Hetero	wt	wt	wt	Hetero	Hetero
PSH48-57-2	T₁	wt	Hetero	wt	wt	wt	Homo	Homo
PSH48-57-3	T₁	wt	Homo	wt	wt	wt	Homo	Hetero
PSH48-57-7	T₁	Homo	Hetero	wt	wt	wt	Homo	Hetero

	注：Hetero，杂合；Homo，纯合
	Note: Hetero, heterozygous; Homo, homozygous

采用CTAB法提取J9707的DNA；采用TRIpure Reagent试剂盒提取总RNA，利用全式金公司反转录试剂盒（EasyScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）将提取的RNA进行反转录。克隆产物送测序公司进行测序。

通过DNAMAN 8.0软件预测其蛋白序列，将蛋白序列导入MEGA7软件，构建系统进化树；在NCBI网站使用CD-Search做蛋白结构预测，并通过在线工具 MEME（ http:// meme-suite. org/）分析各成员的保守Motif，结合TBtools软件整合进化树和Motif结构图。

1.2.2 基因组织表达特异性分析

采集J9707的根、茎、叶片、茎顶端、花、花蕾、7d的角果和14d的种子等组织用于RNA抽提，每个样品取3个生物学重复。利用内参基因 BnActin7通过RT-PCR对cDNA浓度调平，然后用于荧光定量PCR分析。利用全式金公司的qPCR试剂盒（TransStart Top Green qPCR SuperMix）在CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) PCR仪上进行扩增，采用2^ ^(ΔCt)方法计算出基因的相对表达量。具体反应体系如下：cDNA模板5 μL、2×Supermix 7.5 μL、Primer mix (2.5 μmol/L) 2.5 μL。反应扩增条件为：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸15 s，45 cycles，72℃彻底延伸10 min。

1.2.3 编辑载体的构建与转化

靶点设计采用CRISPR-P 2.0（ http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）在线工具，靶点引物见附表1（见首页OSID码）。CRISPR/Cas9载体构建参照Ma等的方法进行 ^{[ 24]}。得到的编辑载体经过测序验证后转入农杆菌感受态，再通过油菜下胚轴遗传转化方法转化油菜受体材料 J9707。具体操作方法参考杨阳 ^{[ 25]}的方法。

1.2.4 突变体的转基因阳性鉴定和编辑鉴定

采用CTAB法提取再生苗基因组DNA，利用编辑载体上的引物PB-L与靶点引物PSH48T₂-R（附表1，见首页OSID码）检测转基因植株阳性，以J9707为阴性对照。对阳性单株利用Hi-Tom方法进行高通量测序，测序数据通过在线网站（ http://www.hi-tom.net/hi-tom/）进行靶点突变基因型分析。

2 结果与分析

**2.1 BnaFZP基因克隆及序列分析**

根据拟南芥同源基因 PUCHI( AT5G18560)序列信息，在网站NCBI上Blast分析确定了 BnaFZP基因在甘蓝型油菜基因组中存在6个同源拷贝，即 BnaA03g07180D、 BnaC03g09100D、 BnaA10g26790D、 BnaC09g39250D、 BnaA02g35090D和 BnaC02g08170D。然后，设计引物分别以J9707 DNA和cDNA为模板扩增和克隆得到所有拷贝的序列；两者比对确定出基因结构（图1）。与拟南芥同源基因 PUCHI序列相比，甘蓝型油菜 BnaFZP的六个拷贝基因结构相同，都只包含一个外显子。

Fig. 1 The gene structure of homologues of FZP gene in Brassica napus

图1 BnaFZP的基因结构

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蛋白质序列分析发现， BnaFZP六个拷贝的序列相似性平均为75%，与拟南芥AtPUCHI蛋白的序列相似性为83%；与单子叶植物水稻和玉米的同源基因序列相似性比较低，低于30%（附表2，见首页OSID码）。系统进化树Motif分析，发现甘蓝型油菜BnaFZP蛋白序列的Motif和拟南芥同源蛋白高度相似，与单子叶植物玉米和水稻的同源基因蛋白序列只共同拥有Motif 1（图2）。在NCBI网站使用CD-Search分析蛋白序列结构域，发现Motif 1是植物蛋白AP2保守结构域；序列比对分析，发现AP2结构域高度保守，仅有个别氨基酸的替换（附图1，见首页OSID码）。

**Fig. 2 Phylogenetic tree and the conserved domain of the BnaFZP gene**

Note: 1: The phylogenetic tree is generated from the alignment of the whole protein sequences after 1000 bootstrap repeats; 2: The prediction results of the conserved domain are distinguished by different display colors; 3: AT5G18560 derived from Arabidopsis thaliana; OsFZP is derived from Oryza sativa; ZmBD1 is derived from Zea mays

图2 BnaFZP基因的进化树和蛋白质保守结构域分析

注：1: 系统进化树是利用基因的完整蛋白进行一千次bootstrap检验得到; 2: 预测到的蛋白质保守Motif用不同颜色显示; 3: AT5G18560、 OsFZP和 ZmBD1分别是拟南芥、水稻和玉米中的同源基因

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**2.2 BnaFZP的表达分析**

利用qRT-PCR的方法检测 BnaFZP各拷贝在转化受体J9707不同组织中的表达模式。结果显示， BnaFZP在甘蓝型油菜各组织中表达量很低，在根、花和角果中表达量相对较高（图3A）。本实验结果与甘蓝型油菜转录组信息资源网站BnTIR （ http://yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR）公布的结果一致（图3B）。

**Fig. 3 Expression patterns of BnaFZP in Brassica napus L.**

Note: A: qRT-PCR for BnaFZP transcripts in different developmental tissues and stages of J9707. The expression was compared to that of the control BnActin7 gene; B: Expression patterns of BnaFZP in ZS11(http://yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR)

图3 BnaFZP在甘蓝型油菜中的组织表达分析

注：A: 利用qRT-PCR检测 BnaFZP在J9707的不同组织中的表达量，以 BnActin7基因为内参。B: BnaFZP在参考基因组ZS11中的表达模式（http://yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR）

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**2.3 甘蓝型油菜 BnaFZP多靶点的CRISPR/Cas9载体构建**

利用CRISPR-P网站在 BnaFZP基因的AP2保守结构域内设计了3个靶点（S1~S3）；图4A）。这些靶点与各拷贝大都无错配；其中，S1靶点序列与 BnaA10g26790D拷贝有一个SNP差异；S2靶点序列与 BnaA10g26790D 和 BnaC09g39250D 拷贝各有一个SNP差异；S3靶点序列与 BnaC03g09100D拷贝有一个SNP差异（图4B）。

**Fig. 4 BnaFZP gene structure with target sequences and schematics of binary plasmid vector**

Note: A: The BnaFZP gene structure includes one exon. The vertical line in the gene structure indicates the target site, and the arrow indicates the sgRNA direction. B: The target sequences are shown with the PAM highlighted in green and the mismatched base highlighted in red. C: Schematic presentation of binary vector BnaFZP

图4 BnaFZP基因结构、靶点序列和CRISPR/Cas9载体示意图

注：A： BnaFZP基因包括1个外显子，靶点（S1-S3）位置用白色的竖线标注，方向用带箭头的水平黑线标注；B：靶点序列中PAM碱基都用绿色的字体强调；红色碱基表示有错配的碱基。C： BnaFZP的CRISPR/Cas9双元载体示意图

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参考Ma等 ^{[ 24]}的方法将3个靶点连入CRISPR/Cas9载体，并分别使用拟南芥AtU3d、AtU3b和AtU6-1启动子驱动，载体命名为PSH48（图4C）。

**2.4 BnaFZP突变体的创建**

将构建好的基因编辑载体PSH48通过农杆菌介导油菜下胚轴的遗传转化方法转化受体J9707，经过植物组织培养共获得185株T₀代再生苗（图5A）。利用引物对PB-L/PSH48T₂-R（附表1，见首页OSID码）对再生苗进行转基因阳性鉴定，获得146株阳性单株，转基因阳性率为79%（图5B）。

Fig. 5 The procedure of genetic transformation in rapeseed and transgenic detection of the regenerated seedlings

Note: A：The procedure of genetic transformation in rapeseed ( Brassica napus L). B：transgenic detection of the regenerated seedlings. wt is J9707 used as the negative control, M represents 3k Maker

图5 BnaFZP编辑载体转化油菜的流程与再生苗的转基因阳性鉴定

注：A：油菜下胚轴遗传转化流程；B：再生苗的阳性检测；wt为阴性对照J9707，M为3k Maker

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为进一步确定转基因阳性单株的基因型，采用Hi-TOM方法对146株阳性苗的靶点进行检测（附表1，见首页OSID码）。结果显示有48株的靶位点序列发生编辑，编辑效率为32.88%。其中，S2靶点的编辑效率最高，而S1和S3靶点未检测到编辑。将T₀编辑单株产生的T₁的植株进行Hi-TOM检测，发现这些突变能够稳定遗传给后代；并且在T₁的部分植株中检测到一些新的突变类型，部分单株 BnaC03g09100D拷贝的S3靶点也能检测到编辑，表明CRISPR/Cas9转基因元件在后代可以继续产生编辑。

对突变类型分析发现，大部分均为1bp的插入或缺失，同时也存在2~8 bp甚至大片段缺失的突变类型，突变位置多在PAM(NGG)上游3 bp处。通过鉴定与筛选，在T₁世代得到各拷贝单独或同时多拷贝发生纯合或杂合编辑的突变体（表1）。

2.5 突变体的表型观察

对T₁获得的不同拷贝及拷贝组合纯合突变单株株型进行表型考察，发现 BnaA02g35090D / BnaC02g08170D纯合双突变体和 BnaC03g09100D / BnaA02g35090D / BnaC02g08170D纯合三突变体在幼苗的基部表现出明显的突变表型，相对于野生型材料只有一个主轴，这些突变体有2~3个主轴（图6）。这些株系均在S2靶点存在1 bp插入突变，导致基因移码和功能丧失。以上结果表明， BnaFZP基因参与分枝数目的调控。

**Fig. 6 Phenotypes of BnaFZP T₁ generation mutants**

Note: A： a₂a₂ c₂c₂ refers to double ( BnaA02g35090D / BnaC02g08170D) homozygous mutant of BnaFZP; B： a₃a₃ a₂a₂ c₂c₂refers to triple ( BnaC03g09100D/ BnaA02g35090D / BnaC02g08170D) homozygous mutant of BnaFZP; C：wt is the wild type J9707

图6 BnaFZP突变体的T₁代表型观察

注：A： a₂a₂ c₂c₂表示 BnaA02g35090D/ BnaC02g08170D纯合双突突变体；B：a₂a₂a₃a₃c₂c₂表示 BnaA02g35090D/ BnaC03g09100D/ BnaC02g08170D纯合三突突变；C： wt为野生型J9707

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3 讨论与结论

FZP在拟南芥中的同源基因参与调控花序分生组织形态建成，并抑制苞叶形成 ¹⁹，其突变体致使部分的花转变成次级花序，但不影响花器官的发育。而其在禾谷类作物如水稻、玉米和小麦中的同源基因功能缺失，将导致植株产生大量穗分枝，并且严重地影响花器官的发育。甘蓝型油菜是双子叶植物，相比拟南芥基因组更为复杂，目前还未有 BnaFZP在甘蓝型油菜中的功能研究报道。

本研究首次利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术成功对 BnaFZP基因进行了定点突变，在T₀代 BnaFZP基因的各个拷贝均能检测到定点突变，表明本研究使用的CRISPR/Cas9工具的高效性。对这些突变单株的编辑位点统计分析，发现这些编辑单株突变位点大多发生在PAM上游3~5bp处，且以单碱基的插入或缺失为主，与以往的研究结果一致。对T₀和T₁的编辑突变分析，发现T₀获得的突变类型能够稳定遗传给后代，并且在T₁还会出现新的编辑类型，说明携带CRISPR/Cas9元件的后代单株仍然可以继续发生编辑。本研究设计的3个靶点具有明显的编辑效率差异，其中S2靶点效率最高、S3靶点仅发生少量编辑，而S1靶点未发现任何编辑。这种编辑效率的差异除了与靶点本身的效率差异有关以外，应该也与sgRNA的不同启动子有关。Yang等利用该基因编辑系统对甘蓝型油菜的CLV途径的多个基因进行定点突变，发现不同的sgRNA启动子会显著影响编辑效率，其中所有使用AtU6-1启动子的靶点也均未检测到任何编辑，与本研究结果完全一致，表明该启动子不适合在油菜中使用 ^{[ 26]}。

本研究在T₁获得了不同拷贝及拷贝组合纯合突变单株，表型考察发现 BnaA02g35090D / BnaC02g08170D纯合双突变体和 BnaC03g09100D / BnaA02g35090D / BnaC02g08170D纯合三突变体仅在幼苗表现出多主轴表型，而未观察到后期花序分生组织的变异，说明 BnaFZP基因的 BnaA02g35090D和 BnaC02g08170D同源拷贝在分枝数量的调控方面发挥重要的功能。这与已报道的拟南芥和禾本科作物中的同源基因调控花序分生组织的功能并不完全一致，表明甘蓝型油菜中该基因的功能出现了明显的分化。由于该基因在甘蓝型油菜中的同源拷贝较多，本研究所获得的纯合突变体组合还不足以明确各个拷贝的功能。在后续研究中还需要继续通过分离或聚合获得更多的突变体组合类型，最终鉴定出每个拷贝的功能。

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1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 基因的克隆及序列分析
Table 1 Genotypic analysis of BnaFZP mutants and their transmission from T0 to T1 generations
1.2.2 基因组织表达特异性分析
1.2.3 编辑载体的构建与转化
1.2.4 突变体的转基因阳性鉴定和编辑鉴定
2 结果与分析
2.1 BnaFZP基因克隆及序列分析
Fig. 1 The gene structure of homologues of FZP gene in Brassica napus
Fig. 2 Phylogenetic tree and the conserved domain of the BnaFZP gene
2.2 BnaFZP的表达分析
Fig. 3 Expression patterns of BnaFZP in Brassica napus L.
2.3 甘蓝型油菜 BnaFZP多靶点的CRISPR/Cas9载体构建
Fig. 4 BnaFZP gene structure with target sequences and schematics of binary plasmid vector
2.4 BnaFZP突变体的创建
Fig. 5 The procedure of genetic transformation in rapeseed and transgenic detection of the regenerated seedlings
2.5 突变体的表型观察
Fig. 6 Phenotypes of BnaFZP T1 generation mutants
3 讨论与结论
References
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Received	Published
2023-03-29	2024-10-28
Issue Date
2024-10-28

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