Preparation of <i>Trichoderma harzianum</i> T-102 bactericide and its effects on peanut sheath blight and soil biodiversity

Li-fang ZHANG; Yang CAO; Lan ZHANG

doi:10.19802/j.issn.1007-9084.2023174

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CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2024, Vol. 46 ›› Issue (6) : 1398-1404. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2023174

Preparation of Trichoderma harzianum T-102 bactericide and its effects on peanut sheath blight and soil biodiversity

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Abstract

Peanut sheath blight caused by Rhizoctonia solani is an significant soil-borne disease in peanut production, which can seriously threaten the safety of peanut production and quality, and is the main obstacle factor in the sustainable and healthy development of peanut industry. In this study, the isolated Trichoderma harzianum strain T-102 with excellent control efficiency was cultured by submerged fermentation technology. Under the optimal conditions of 150 r/min, 20℃ and the initial inoculation concentration of 7.5%, the water suspension of T. harzianum T-102 with 10⁵ cfu/mL was obtained. In Linyi city, Shandong province and Tangshan city, Hebei province, the water suspension of T. harzianum T-102 exhibited the great effect for controlling peanut sheath blight in the field. After spraying the water suspension of T. harzianum T-102, the disease index of peanut sheath blight was significantly reduced. Moreover, the yield of peanut could be increased by 41.2% and 31.7% in Linyi city and Tangshan city, respectively. In addition, the water suspension treatment could change the structure and composition of microbial communities of peanut rhizosphere, and reduce the abundance of harmful microorganisms. Based on the above characteristics, the water suspension of T. harzianum T-102 is expected to carry out further commercial development and application.

Key words

peanut sheath blight / Rhizoctonia solani / Trichoderma / water suspension concentrate / biological control

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Li-fang ZHANG , Yang CAO , Lan ZHANG. Preparation of Trichoderma harzianum T-102 bactericide and its effects on peanut sheath blight and soil biodiversity[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2024, 46(6): 1398-1404 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2023174

花生是一种重要的油料作物和经济作物，蛋白质、脂肪、碳水化合物及不饱和脂肪酸含量丰富，是世界上公认的健康食品之一^[1,2]。然而，随着气候的变化和连作的增加，病虫危害引发的连坐障碍越发严重，严重威胁着花生的生产和质量安全^[3-7]。由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的花生纹枯病（Peanut sheath blight）是花生生产中的一种重要病害。该病害寄主广泛，可侵染花生在内的54科200多种植物。花生患病后，一般减产10%~20%，重者减产30%~50%，甚至可造成绝收^[8~10]。目前对花生纹枯病的防治仍以化学防治为主，戊唑醇、苯醚甲环唑、噻呋酰胺、嘧菌酯、氟酰胺、菌核净、井冈霉素等是目前生产中常用的化学农药，但由于化学农药大面积的应用，病原菌对各种化学农药抗药性越来越强^[11~15]。而且，化学农药的大量及不合理施用，对生态环境造成极大的破坏，严重威胁着食品安全和人类健康。虽然世界各国制定了严格的管控措施，但防治效果并不理想，归咎其原因主要有以下几点：一是没有专门针对花生纹枯病控制开发的有效药剂，包括生物农药；二是绿色生态调控技术的欠缺，缺乏源头有效的防控技术体系和管理措施；三是农艺措施管理不到位，没有良好的综合管理办法。正是由于花生生产中存在这些不足，导致各国花生纹枯病病害严重发生而无法根治，严重威胁花生的生产和质量安全^[16~19]。随着科学技术水平的发展以及人们生活水平的不断提高，利用有益微生物控制花生纹枯病越来越受到人们的重视和关注^[14]。

目前在花生纹枯病的生物防治中，有益功能细菌、真菌和放线菌是主要应用的三个微生物种类。科研人员从花生根部筛选到多株对立枯丝核菌有较强抑制作用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、绿针假单孢杆菌（Pseudomonas chlororaphis）和荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens）等拮抗功能菌株，其中枯草芽孢杆菌对纹枯病的防治效果最好^[12-16]。但利用有益真菌来防控花生纹枯病的研究并不深入，为此，本实验室开展了相关研究。我们从患病花生田块健康的植株根部分离获得对花生纹枯病菌有较强抑制作用的哈茨木霉菌株T-102，利用微生物液体深层发酵的方法，探究最适的发酵条件，研制合适的剂型，开展了田间防控试验研究，分析了生防木霉菌T-102对土壤微生物多样性和种群结构的影响，为生防木霉菌T-102的规模化生产和商品制剂的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：所用木霉菌株T-102由本实验室提供。

PDA培养基^[4]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20ｇ，蒸馏水1000 mL。

LB培养基^[4]：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠 10 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL。

液体深层发酵培养基：葡萄糖250 g，蛋白胨250 g，酵母提取物75 g，蒸馏水20 L。

1.2 发酵条件优化及菌剂制备

为了探究生防哈茨木霉菌株T-102发酵条件和发酵工艺，优化液态菌剂的生产条件，需要分析菌株T-102发酵过程中的转速、温度、初始接种浓度这三者的最佳组合，针对这些问题，我们进行了L₉(3³)正交试验，测量48 h后各处理每100 mL发酵液的生防菌株的繁殖体数量和干重，找出最佳发酵条件，每个组合设三个重复。其实验设计如表1所示。

Table 1 The treatments of L₉(3³) orthogonal test

表1 L₉(3³)正交试验各处理一览表

处理 Treatment	转速 /（r/min） Rotation rate	温度 /℃ Temperature	初始接种浓度 /%，V/V Inoculation quantity
1	150	18	2.0
2	150	20	5.0
3	150	22	7.0
4	200	18	5.0
5	200	20	7.0
6	200	22	2.0
7	250	18	7.0
8	250	20	2.0
9	250	22	5.0

1.3 田间防治效果

2021-2022年，于山东临沂试验田与河北唐山试验田进行田间防效试验。选取花生苗期、蕾花期和下针期这3个生长时期进行施药，且设置不同生长期连续施药处理。因此共有苗期喷施、蕾花期喷施和下针期喷施3个单独生长期喷施处理，以及苗期、蕾花期连续喷施和苗期、蕾花期和下针期喷施处理2个不同生长期连续喷施处理，以及空白对照共6个处理。每个处理设置3个重复，每个实验小区面积为100 m²。每次喷施，以每公顷施用10%的菌悬液225 L为标准进行。在花生成熟期进行病害防治效果的调查，并在收获后进行产量测定。

在花生成熟期，于每个小区中随机选取 100 株花生进行发病率和病情指数的调查，和防治效果的计算。花生植株根据发病程度被评定为 0 至 4 级。0 级：没有病斑；一级：少于 1/3 的侧枝发病，或侧枝不发病，但主茎病斑小于 3 cm；二级：1/3 到 2/3 的花生侧枝发病，或少于 1/3 的侧枝发病，但是主茎病斑大于3 cm；三级：2/3的侧枝发病，或少于2/3 的侧枝发病，但是主茎病斑大于3 cm；四级：大于2/3的侧枝发病，或者小于2/3的侧枝发病，但是主茎病斑大于10 cm。

病情指数的计算公式如下：

病情指数=100×∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）

1.4 生防木霉T-102对花生根际土壤微生物多样性的影响

生防木霉菌对花生纹枯病具有较好的防治效果，为探明应用生防菌后是否因为能够抑制病原菌的丰度及提升了土壤微生物种群多样性，达到控制病害发生，我们利用高通量测序技术分析了土壤微生物区系变化。细菌总DNA的提取使用E.Z.N.A.^® Soil DNA Kit试剂盒，按照说明提取样品总DNA。以微生物总DNA为模板进行PCR扩增，2% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit回收纯化目的条带，采用QuantiFluor: trademark: ST (Promega, U.S.)对回收片段进行定量。回收片段按照定量混合后采用Illumina HiSeq 2500测序平台PE 250测序策略进行高通量测序并分析下机数据。使用Usearch软件通过Silva(v128,http://www.arb-silva.de)和Unite(http://unite.ut.ee/index.php)^[20,21]数据库对16S和ITS进行比对获得物种注释信息进行物种注释。菌群多样性（Community diversity）采用Shannon指数值说明^[20,21]。

2 结果与分析

2.1 发酵条件的优化

正交实验结果表明（表2），在温度、转速和初始接种浓度三个因素中，首先温度对发酵产物干重影响最大，其次是初始接种浓度，最后是转速。在所涉及的三个转速中，最优转速为150 r/min。在所涉及到的三个温度梯度中，20℃为最佳温度，其次为22℃和18℃。在哈茨木霉菌株T-102不同初始接种浓度中，随着初始接种浓度的增加干重增加。因此，最优的发酵条件为150 r/min、20℃和初始接种浓度为7.0%时（表2）。按照上述发酵条件，进行了液体菌剂生产，按照1×10⁵含菌量制备液体菌剂，用于田间病害防控试验。

Table 2 Results of orthogonal test

表2 正交结果一览表

因素 Factor	转速 Rotation rate	温度 Temperature	初始接种浓度 /（V/V） Inoculation quantity	干重 /（g/L） Dry weight
1	150 r/min	18℃	2.0%	2.893
2	150 r/min	20℃	5.0%	4.412
3	150 r/min	22℃	7.0%	3.568
4	200 r/min	18℃	5.0%	3.398
5	200 r/min	20℃	7.0%	4.299
6	200 r/min	22℃	2.0%	2.798
7	250 r/min	18℃	7.0%	3.390
8	250 r/min	20℃	2.0%	3.464
9	250 r/min	22℃	5.0%	3.136
K1	10.874	9.683	9.156
K2	10.496	12.176	10.948
K3	9.992	9.504	11.259
k1	3.625	3.228	3.052
k2	3.499	4.059	3.649
k3	3.331	3.168	3.753
R	0.294	0.891	0.701
F	65.749**
	10.400	118.465**	68.383*

2.2 田间防效试验

通过在临沂和唐山两地进行的田间试验，发现生防木霉菌T-102菌悬液喷施处理可以显著降低花生纹枯病的病情指数和发病率。在临沂试验田，与对照组病情指数38.72相比，蕾花期喷施处理、下针期喷施处理及苗期、蕾花期和下针期三个生育时期连续喷施处理的病情指数显著降低，病情指数平均值分别为23.70、24.71和24.95（表3）。在唐山试验田，与对照组的病情指数40.75相比，苗期、蕾花期两个生育期的连续喷施处理与苗期、蕾花期和下针期三个生育期的连续喷施处理的病情指数显著降低，病情指数分别为27.91和28.50（表3）。通过试验田进行的花生产量调查发现，临沂试验田各处理之间有显著性差异，同对照区的278.45 kg相比，苗期、蕾花期两个时间点的喷施处理及苗期、蕾花期、下针期三个时间点的喷施处理产量分别为294.10 kg和301.32 kg（表4），增产效果显著。在唐山试验田，同对照区的241.87 kg相比，苗期、蕾花期、下针期三个时间点的喷施处理产量为256.74 kg和264.37 kg，增产显著（表4）。综上所述，苗期、蕾花期和下针期三个时间点的喷施处理是最优的生防菌使用方式，可以有效地降低花生纹枯病的发生，增加花生产量。

Table 3 Field control effect of Trichoderma strain T-102

表3 哈茨木霉菌株T-102田间防控效果

地点 Site	处理 Treatment	病情指数 Disease index			平均值 Mean value	标准差 Standard deviation	显著水平 Significant level	P值 P value
地点 Site	处理 Treatment	1	2	3	平均值 Mean value	标准差 Standard deviation	显著水平 Significant level	P值 P value
	A	43.50	39.87	32.62	38.72	5.537279	a	0.036
	B	29.87	31.25	34.75	31.94	2.513505	b
临沂 Linyi	C	26.75	20.37	23.87	23.70	3.192602	ab
	D	29.12	31.00	14.00	24.71	9.320955	b
	E	37.00	29.50	28.12	31.54	4.776788	ab
	F	19.55	28.00	27.37	24.95	4.737374	b
	A	41.75	39.75	40.75	40.75	1.000000	a	0.002
	B	45.50	31.00	37.00	37.83	7.285831	ab
唐山 Tangshan	C	40.50	41.75	38.75	40.16	1.506928	ab
	D	38.50	33.00	30.00	33.66	4.041452	bc
	E	29.35	25.00	29.75	27.91	2.553592	c
	F	31.45	27.00	27.50	28.50	2.179449	c

	注：A：对照组；B：苗期喷施处理；C：蕾花期喷施处理；D：下针期喷施处理；E：苗期、蕾花期连续喷施处理；F：苗期、蕾花期、下针期连续喷施处理
	Note: A: Control group; B: Spraying treatment at seedling stage; C: Spraying treatment during bud and flowering period; D: Spraying treatment under the needle period; E: Continuous spraying treatment at seedling stage and bud flowering stage; F: Continuous spraying treatment at seedling stage, bud and flower stage and needling stage

Table 4 Effects of each treatment on peanut production

表4 各处理对花生产量的影响

地点 Site	处理 Treatment	产量 Yield /（kg/667m²）			平均值 Mean value	标准差 Standard deviation	显著水平 Significant level	P值 P value
地点 Site	处理 Treatment	1	2	3	平均值 Mean value	标准差 Standard deviation	显著水平 Significant level	P值 P value
	A	276.64	284.23	274.49	278.45	11.103	a	0.102
	B	286.94	295.25	285.52	289.23	11.0070	a
临沂 Linyi	C	274.63	284.58	271.76	276.99	12.7013	a
	D	297.49	295.56	289.19	294.10	18.1860	b
	E	272.26	279.08	271.24	274.19	6.40692	b
	F	292.39	299.26	312.23	301.32	5.10020	c
	A	243.97	238.58	243.06	241.87	2.88382	a	0.005
	B	249.73	241.83	243.83	245.13	4.11048	a
唐山 Tangshan	C	242.99	242.61	247.63	244.41	2.79620	a
	D	242.92	252.02	243.62	246.19	5.06098	a
	E	249.85	249.67	270.71	256.74	0.55751	b
	F	254.28	262.70	276.12	264.37	1.70991	b

	注：A：对照组；B：苗期喷施处理；C：蕾花期喷施处理；D、下针期喷施处理；E：苗期、蕾花期连续喷施处理；F：苗期、蕾花期、下针期连续喷施处理
	Note: A: Control group; B: Spraying treatment at seedling stage; C: Spraying treatment during bud and flowering period; D: Spraying treatment under the needle period; E: Continuous spraying treatment at seedling stage and bud flowering stage; F: Continuous spraying treatment at seedling stage, bud and flower stage and needling stage

2.3 哈茨木霉菌株T-102对土壤微生物多样性的影响

试验结果表明，接种哈茨木霉菌株T-102后会对花生根际微生物多样性产生一定的影响，但大部分土壤微生物种群结构和多样性存在一致性，表明微生物具有高度的保守性和稳定性，这对保障花生的健康发育和逆境适应性具有重要的作用。研究结果还表明，哈茨木霉菌株T-102对花生根际微生物的影响大于空白土壤。

2.3.1 土壤细菌多样性影响

所有样品主要注释到3个门：Proteobacteria（0.381±0.002，95%置信区间），Actinobacteria（0.167±0.002)，Chloroflexi（0.085±0.002），其中变形菌门（Proteobacteria）为绝对优势菌（图1）。在部分分组中变形菌门的丰度差异很大：临沂样品（SL)相对丰度最低（0.29±0.03），而唐山样品(HT)丰度最高（0.42±0.04）（图1）。

Fig. 1 Effects of strainT-102 on rhizosphere bacterial microorganisms

图1 菌株T-102对花生根际细菌微生物群落的影响

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2.3.2 土壤真菌多样性影响

所有样品主要注释到3个门：Zygomycota（0.03±0.01，95%置信区间），Basidiomycota（0.10±0.02），Ascomycota（0.82±0.02），其中子囊菌门（Ascomycota）为绝对优势菌。在部分分组中子囊菌门的丰度差异很大：唐山样品（HT）相对丰度最低（0.69±0.06），而临沂样品(SL)丰度最高（0.94±0.02）（图2）。

Fig. 2 Effects of strainT-102 on rhizosphere fungal microorganisms

图2 菌株T-102对花生根际真菌微生物的影响

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3 结论与讨论

利用拮抗微生物防治作物真菌病害的研究已引起人们广泛的关注，例如哈茨木霉（Trichoderma harzianum）防治辣椒疫霉病和马铃薯晚疫病^[22]，淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）抑制尖孢镰刀菌的孢子萌发与菌落生长^[23]，哈茨木霉（Trichoderma harzianum）防治花生黄曲霉真菌病害^[6]，黄绿木霉菌（Trichoderma aureoviride）防治花生镰孢菌根腐病等^[24]。木霉真菌（Trichoderma spp.）是国际上公认的防治作物真菌病害的重要生防因子，目前全世界多个国家已商品化并得到大规模应用。研究表明，生防木霉菌对土传病原真菌抑制机理广泛，主要包括竞争作用、寄生作用和诱导抗性等^[25~28]。花生真菌病害加重的重要原因是病原菌在土壤内大量富集，导致土壤微生物群落结构和多样性发生改变，增加土壤中功能微生物的种群数量，就能很好的控制病原真菌的数量，增强花生植株对病害的抗性^[29]。

目前利用有益真菌来防治花生纹枯病的研究鲜有报道，本实验筛选获得一株对花生纹枯病具有较强拮抗效果的哈茨木霉菌株T-102，且开展了哈茨木霉T-102液体深层发酵的方法的探索。利用液体深层发酵技术，通过探究发酵过程中的关键因素，利用正交实验优化法，得到了哈茨木霉T-102菌株液体深层发酵的最适条件，即在150 r/min，20℃，初始接种浓度为7.0%的佳条件下，培养60 h，得到了活菌数达10⁵ cfu/mL的水悬浮剂。为了发挥微生物菌剂的效果，增加其稳定性和使用的便捷性，必须要在其中添加各种助剂，配制成合适的剂型。

对于本研究所涉及的生物杀菌剂来说，最重要的是阻止制剂在生产贮藏过程中产生污染，发生腐败，以避免影响制剂的货架期。唐善军等在研发盾壳霉分生孢子水悬浮剂时，使用硫酸链霉素作为防腐剂，并取得了良好的效果^[30]。燕瑞斌等在开发盾壳霉分生孢子水悬浮剂时，添加了海藻糖作为保护剂，提高了水悬浮剂的贮藏性能，延长了货架期^[31]。为提高防控效果稳定性，本研究发现在苗期、蕾花期、下针期连续喷施处理，病情指数出现显著下降的现象，因此使用次数和时期也值得重视。未来应重点开展菌剂的防腐剂研究，提升菌剂的效能，同时如何保证贮藏稳定性，延长货架期，便成后续剂型优化的重点。

本实验对开发的菌剂开展了花生纹枯病防控田间试验，唐山和临沂两地试验结果表明，哈茨木霉菌株T-102对花生纹枯病防控效果较强，进一步发现，T-102能够显著地提升花生的产量，具有极高的开发应用潜力。同时，应用T-102对花生根际微生物种群结构和多样性产生一定的积极影响，但大部分土壤微生物种群结构和多样性存在一致性，表明花生根际微生物具有高度的保守性和稳定性，这对保障花生的健康发育和逆境适应性具有重要的作用。下一步将对哈茨木霉菌株T-102的拮抗纹枯病的机制、种群结构调控原理和微生物菌剂的深层次多种类开发进行重点研究。通过对这些微生物技术的开发，相信未来会对我国花生等油料作物的病虫害高效防控、产量安全和质量安全的提升及土壤生态环境的改善和修复起到重要的促进作用。

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Received	Published
2023-07-10	2024-12-25
Issue Date
2024-12-18

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