Transcriptomic analysis on the flower color changes of white-petaled BnaC3.CCD4-transgenic rapeseed (Brassica napus) linesduring the daytime

Jin-ting WANG, Xue-yu SUN, Wen-jing HU, Qian YANG, Chao LIU

CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2025, Vol. 47 ›› Issue (1) : 45-59.

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CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES ›› 2025, Vol. 47 ›› Issue (1) : 45-59. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2023278

Transcriptomic analysis on the flower color changes of white-petaled BnaC3.CCD4-transgenic rapeseed (Brassica napus) linesduring the daytime

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Abstract

Our previous study revealed that BnaC3.CCD4 encodes carotenoid cleavage dioxygenas whose mutations altered flower color from white to yellow in rapeseed. Interestingly, we observed that the white flowers of functional BnaC3.CCD4 transgenic lines showed pale yellow in the morning and still became pure white in the afternoon during the daytime. In order to explore whether environmental signals such as light and temperature have a regulatory effect on carotenoid biosynthesis and metabolism, RNA-seq was performed for transcriptomic analysis on them at two different timepoints in the present research. The analysis results of gene ontology (GO) and kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) revealed that a number of differential expression genes were significantly enriched in pathways related to light signal, circadian rhythm, stimulus response and carotenoid biosynthesis et al. Through further analyzing the top 50 differentially expressed genes, it was revealed that the light signal might be the key factor for the flower color change of BnaC3.CCD4 transgenic lines. Therefore, it was inferred that the light signal factors potentially regulate the expressions of the genes in the carotenoid biosynthesis pathway by binding to their photoresponsive elements to control the carotenoid contents in the petals and then cause their color change.

Key words

Brassica napus / flower color / carotenoid cleavage dioxygenas / light signal / circadian rhythm

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Jin-ting WANG , Xue-yu SUN , Wen-jing HU , Qian YANG , Chao LIU. Transcriptomic analysis on the flower color changes of white-petaled BnaC3.CCD4-transgenic rapeseed (Brassica napus) linesduring the daytime[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2025, 47(1): 45-59 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2023278
植物花瓣的颜色具有多种生物学功能。它不仅可以提供视觉信号,吸引昆虫和鸟类传播花粉 [1, 2],而且它能够通过吸收和反射不同波长的光波来平衡花瓣能量,从而防止花瓣被光灼伤并且维持花器官正常的生理功能[3,4]。同时,色彩缤纷的各种植物花瓣还具有极高的观赏价值,可以愉悦人们的身心[5]
自然界的花色主要由类黄酮、类胡萝卜素和生物碱这三大类色素决定[6]。其中类黄酮化合物具有2-苯基色原酮结构,是一种次级代谢物[7],广泛分布于植物的花、叶、果实等器官中,颜色分布在淡黄色到蓝色之间。而生物碱是酪氨酸的次生代谢物,主要储存在液泡中,颜色分布在黄色到红色之间。类胡萝卜素是由异戊二烯单元组成的萜类物质,广泛存在于植物和微生物中,能使植物花瓣呈现出黄、橙、红等颜色[6,8]。我们前期的研究发现,油菜黄花品种花瓣中类胡萝卜素的含量极显著高于白花品种,因此油菜花瓣的黄色主要是由类胡萝卜素形成[9]。在植物体内,类胡萝卜素的合成主要是通过异戊二烯途径完成的,而类胡萝卜素的氧化裂解则主要是由类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase, CCD)进行催化介导的[10]。拟南芥中CCD家族共包括NECD2、NECD3、NECD5、NEDC6、NECD9、CCD1、CCD4、CCD7CCD8这9个成员,其中CCD1参与类胡萝卜素衍生的芳香类物质的生物合成,CCD4则主要参与植物果实和花瓣等器官中类胡萝卜素积累的调控[11]。我们前期的研究发现甘蓝型油菜CCD4有四个拷贝,其中BnaC3.CCD4拷贝由于在编码区存在CACTA类型转座子的插入而失活,从而使油菜花色从野生型的白色变为黄色[9]。在芸薹属物种白菜和芥菜型油菜中发现,通过类胡萝卜素的酯化过程,也可以调控花瓣中类胡萝卜素的积累,进而导致油菜植株呈现出黄白花色的分化[12,13]。另外,甘蓝型油菜中编码玉米黄质环化酶(ZEP)的两个同源基因BnaA09.ZEPBnaC09.ZEP同时突变会影响花瓣中类胡萝卜素的生物合成,导致花瓣中叶黄素含量显著增加而紫黄质含量显著下降,从而使黄花转变为橙花[14]
在本研究中,我们发现在白天,BnaC3.CCD4转基因白花油菜开放的花朵在上午呈现淡黄色而下午才呈现纯白色。拟通过转录组分析,全面揭示油菜花色调控的生物学过程及相关代谢途径,为进一步研究光温等环境信号调控类胡萝卜素合成代谢机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BnaC3.CCD4转基因甘蓝型油菜纯白花株系由本实验室在前期的研究中创制,转化受体为春性油菜黄花品种Westar[9]。随机选择三个纯白花株系,作为三次生物学重复。在盛花期的同一天的9:30和14:30分别取它们当天盛开花朵的花瓣,依次命名为A1、A2、A3和P1、P2、P3,用于花色色度值、类胡萝卜素含量检测以及转录组测序。

1.2 方法

1.2.1 花瓣的色度值检测

利用分光色差仪(品牌: KONICA MINOLTA; 型号:CM-5)对花瓣的色度值进行检测,主要通过L*、a*、b*这三个值对样品颜色进行量化,其中 L*值表示明亮度,L*=100代表白色,L*=0代表黑色;a*值表示红绿色度,+a*代表绿色,-a*代表红色;b*值表示黄蓝色度,+b*代表黄色,-b*代表蓝色。对A1、A2、A3、P1、P2和P3六个样品花色的L*、a*、b*值进行检测,每个样品连续检测六次取其平均值。

1.2.2 花瓣中类胡萝卜素总量的测定

先在液氮中研磨油菜花瓣,称取约0.2 g粉末放入50 mL的试管,再加15 mL色素提取液(正己烷:丙酮:乙醇=2:1:1,含0.1%BHT),磁力搅拌器震荡30 min后4000 g离心10 min,转移上清至另一50 mL离心管,沉淀用15 mL色素提取液重复提取两次至无色。将上清液合并,并在50 mL的分液漏斗中用饱和 NaCl(10%)水溶液反复洗三次至中性,弃下层(水层),用正己烷于容量瓶中定容至25 mL,再用紫外分光光度计测量色素提取液在450 nm处的吸光值,类胡萝卜素的总量利用 β-胡萝卜素的消光系数(E1%=2505)进行估算。

1.2.3 RNA提取和文库的构建

使用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)对A1、A2、A3、P1、P2、P3六个样品花瓣的RNA进行提取,并用1%的琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测RNA质量,委托上海美吉生物医药科技有限公司进行文库构建和样品的转录组测序。本研究采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法进行文库构建,测序平台为Illumina Novaseq 6000,分别对样品进行测序,共获得6份转录组数据。

1.2.4 测序数据的处理和功能注释

首先,对测得原始数据进行质量评估,将reads的接头序列及含N端比率超过10%的片段去除,并剪切掉3'过滤端低质量碱基,获得质控数据(Clean Data)。进一步通过Hisat2软件将其与甘蓝型油菜品种中双11参考基因组进行比对,并分析测序饱和度、测序覆盖度及Reads在不同区域和不同染色体的分布情况。然后使用StringTie软件将mapped reads 组装拼接,对新的转录本进行功能注释。

1.2.5 差异表达基因分析

通过RSEM软件对不同基因的表达量进行定量分析,并使用TPM值衡量其表达水平。然后使用基于负二项分布的DESeq2软件进行统计检验,并对统计检验获得的p-value利用BH多重检验的方法进行矫正得到p-adjust,以p-adjust小于0.01且样本基因表达量上调或下调3倍以上作为标准筛选差异表达基因。通过Goatools软件进行差异表达基因的GO和KEGG的功能注释以及富集分析,选择可能调控花色变化相关的代谢通路进行分析,进一步解析其生物学过程。

1.2.6 DEG的蛋白质相互作用分析

为预测差异表达基因(DEG)的蛋白质与蛋白质的相互作用(PPI),在STRING数据库中输入DEG的蛋白质名称,进行DEG蛋白相互作用分析,构建出PPI网络图。将获得的PPI信息以tsv格式导入Cytoscape软件中,以介数中心度(Betweenness Centrality,BC)值为标准,利用CyToHubba插件筛选出关键DEG,可视化后得到关键DEG的蛋白互作网络图[15, 16]

2 结果与分析

2.1 BnaC3.CCD4转基因株系花瓣颜色观察和分析

我们前面的研究结果表明在甘蓝型油菜中,BnaC3.CCD4由于存在7.6kb的CACTA转座子的插入而失活,使油菜花色由白色变为黄色[9]。在本研究中,对同一天盛开的BnaC3.CCD4转基因植株白花花瓣进行观察,发现其花色在上午和下午呈现出不同的颜色,在9:30时为浅黄色,在14:30时才呈现纯白色(图1A,B)。进一步利用色差仪测量两个时间点的花瓣色度值,结果显示在9:30,花瓣的L*值、a*值和b*值分别分布在75.4~76.9、-4.1~-3.0和 22.7~27.4之间。在14:30,这三个值分别分布在78.8~80.9、-3.9~-3.1和10.24~11.56之间(图1C)。其中L*值表示明亮度,值越大表示明度越高,a*值表示红色(-a*)到绿色(+a*)之间的色度,b*值表示蓝色(-b*)到黄色(+b*)之间的色度。分析发现,花瓣在14:30时相较于9:30的L*值和a*值分别增加4.25%和4.97%,但不存在显著差异。而在14:30时,花瓣的b*值显著减少了55.65%(P<0.05)(图1C)。结果表明,BnaC3.CCD4转基因植株的花色在白天由浅黄色变为纯白色,主要通过b*值体现,本研究中下午花瓣的b*值显著减少,花瓣的黄色色度值明显降低,花色变为纯白色。
Fig. 1 Flower colors and their values of BnaC3.CCD4 transgenic plants at different time points
Note: A: the petals of BnaC3.CCD4 transgenic lines taken at 9:30,A1, A2 and A3 are three biological replicates; B: the petals of BnaC3.CCD4 transgenic lines taken at 14:30,P1, P2 and P3 are three biological replicates; C: L* value represents brightness, L*=100 represents white, L*=0 represents black; a* indicates the degree of red and green. +a* indicates green, and -a* indicates red. b* indicates the yellow and blue degree. +b* indicates yellow and -b* indicates blue; ∗ indicate significantly different (P<0.05)

图1 不同时间点BnaC3.CCD4 转基因植株花色及其色度值

注:A:在9:30 时所取的BnaC3.CCD4转基因白花株系花瓣,A1、A2、A3代表三次生物学重复; B:在14:30时所取的BnaC3.CCD4转基因白花株系花瓣,P1、P2、P3代表三次生物学重复;C:L*值表示明亮度,L*=100代表白色,L*=0代表黑色;a*值表示红绿色度,+a*代表绿色,-a*代表红色;b*值表示黄蓝色度,+b*代表黄色,-b*代表蓝色;∗表示差异显著(P<0.05)

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进一步对两个不同时间点的BnaC3.CCD4转基因植株花瓣的类胡萝卜素含量进行测定(图2),结果显示在9:30,花瓣中类胡萝卜素含量为7.8±0.8 μg/g,而在14:30,花瓣中类胡萝卜素含量为3.8±0.3 μg/g,显著降低了51%。
Fig. 2 Carotenoid contents of BnaC3.CCD4 transgenic plant petals at different time points
Note: ∗∗ indicate significantly different (P<0.01)

图2 不同时间点BnaC3.CCD4 转基因植株花瓣类胡萝卜素的含量

注:∗∗表示差异显著(P<0.01)

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2.2 转录组测序数据的获得与质控处理

在两个时间点取BnaC3.CCD4转基因植株花瓣为转录组测序样品,并分别命名为A组(9:30)和P组(14:30)。对获得的原始数据(Raw reads)进行质控,获得高质量数据(Clean Data)。本研究各样品的Clean Data均达到6.16 Gb以上,其碱基测序错误率在0.27%以下,Q20碱基百分比在97.29%以上,Q30碱基百分比在92.34%以上,GC含量在46.40%以上,共获得43.62Gb的Clean Data,说明此次测序数据质量符合进一步分析要求。

2.3 差异表达基因筛选

本转录组测序分析将A组作为对照组,以p-adjust< 0.01,FC≥3为标准,在P组中共筛选出6891个差异表达基因(DEG)。如图3所示,与A组样品相比,P组样品中有3149个基因显著上调表达,3742个基因显著下调表达。
Fig. 3 Volcanic map of transcriptome expression differences in BnaC3.CCD4 transgenic lines
Note: Red dots indicate up-regulated genes and blue dots indicate down-regulated genes

图3 BnaC3.CCD4转基因株系转录组表达量差异火山图

注:红色圆点表示上调表达的基因,蓝色圆点表示下调表达的基因

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2.4 差异表达基因GO功能注释及富集分析

GO分析结果显示,有5977个DEG被注释到生物学过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular compone,CC)和分子功能(molecular function,MF)这三大类别中,每个类别分别注释到22、14和14个terms(图4)。DEG在BP方面主要注释到细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)、生物调节过程(biological regulation)及刺激应答过程(response to stimulus),分别占35.4%、27.7%、16.9%和15.7%;在CC方面主要注释到细胞组分(cell part)、细胞器(organelle)及膜组分(membrane part ),分别占45.4%、31.0%和29.2%;而在MF方面,主要注释到结合(binding)和催化活性(catalytic activity)上,分别占41.9%和38.4% 。
Fig. 4 GO annotation and classification of the transcriptomic DEGs of BnaC3CCD4-transgenic lines

图4 BnaC3.CCD4转基因株系转录组差异表达基因GO注释分类

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GO富集结果显示,上调表达的DEG显著富集在生物学过程中,如5.8S rRNA的成熟(maturation of 5.8S rRNA,GO:0000460)、噻唑生物合成过程(thiazole biosynthetic process,GO:0052837)、噻唑代谢过程(thiazole metabolic process,GO:0052838)、恶唑生物合成过程(oxazole or thiazole biosynthetic process,GO:0018131)及恶唑代谢过程(oxazole or thiazole metabolic process,GO:0046484)等(图5)。其中富集程度最显著的GO类别是5.8S rRNA的成熟,该类别包括BnaC09G0508100ZS、BnaA10G0208100ZS、BnaC03G0073200ZS、BnaA03G0064000ZS、BnaA02G0059800ZS、BnaC02G0069400ZS这6个含有WD40重复蛋白序列的ATPEP2基因,ATPEP2基因的表达受到植物损伤或病原的诱导[17]
Fig. 5 Top 20 GO enrichment terms of up-regulated differentially expressed genes from the transcriptomes of BnaC3CCD4 transgenic lines

图5 BnaC3.CCD4转基因株系转录组上调差异表达基因GO富集前20 terms

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下调表达的DEG则显著富集在多条与光照相关的通路,如向光性(phototropism,GO:0009638),光信号转导(phototransduction,GO:0007602),红光、远红光光转导(red, far-red light phototransduction,GO:0009585)等。另有37个下调表达的DEG显著富集在昼夜节律(circadian rhythm,GO: 0007623)中,其中包括组成生物钟核心震荡器的基因LHY(2个DEG)、PRR9(3个DEG)和TCP21(2个DEG)[18],以及属于bZIP家族的转录因子HY5(4个DEG),HY5的表达受光信号的调节,且其作为转录因子能够与光响应元件G-box结合[19, 20]。另外,部分下调表达的DEG显著富集在生长素运输(auxin transport,GO:0060918)、生长素介导的信号通路(regulation of auxin mediated signaling pathway,GO:0010928)以及赤霉素介导的信号通路(gibberellic acid mediated signaling pathway,GO:0009740)等植物激素相关的通路中(图6)。
Fig. 6 Top 20 GO enrichment terms of down-regulated differentially expressed genes from the transcriptomes of BnaC3CCD4 transgenic lines

图6 BnaC3.CCD4转基因株系转录下调差异表达基因GO富集前20 terms

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2.5 差异表达基因KEGG功能注释及富集分析

KEGG分析结果表明,有2277个DEG被注释在125个通路中,其中66.10%的DEG注释在代谢(Metabolism)功能中,其余的DEG分别注释在遗传信息处理(genetic information processing)(占15.15%)、环境信息处理(environmental information processing)(占9.31%)、细胞过程(cellular processes)(占4.00%)、生物体系统(organismal systems)(占5.05%)和人类疾病(human diseases)(占0.39%)中(图7)。
Fig. 7 KEGG annotation and classification of transcriptomic DEGs in BnaC3.CCD4-transgenic lines

图7 BnaC3.CCD4转基因株系转录组差异表达基因KEGG注释分类

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其中上调表达的DEG多富集于合成及代谢通路,其中核糖体生物合成(ribosome biogenesis in eukaryotes,K14567)通路的富集程度最显著,且此通路DEG最多(80个)。而缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解(valine, leucine and isoleucine degradation,K01968),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine, aspartate and glutamate metabolism,K16871),硫胺素代谢(thiamine metabolism,K00939)等通路分别有19、22和8个DEG显著富集。同时,有15个上调表达的DEG也富集到了植物昼夜节律(circadian rhythm-plant,K12120)中,包括参与调控生物钟系统的 APRR1(3个DEG)和ELF3(1个DEG)[18],以及编码光敏色素的蛋白PHYC(1个DEG)等(图8)。
Fig. 8 KEGG enrichment of up-regulated differentially expressed genes in the transcriptomes of BnaC3.CCD4 transgenic lines

图8 BnaC3.CCD4转基因株系转录组上调差异表达基因KEGG富集

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下调表达的DEG则在植物激素信号转导(plant hormone signal transduction,K14491)通路的富集程度最显著,且此通路含DEG的数目最多(99个),包括生长素、赤霉素、脱落酸、细胞分裂素等激素合成及代谢的相关基因,由此推测光温的变化影响植物激素的合成、降解及信号转导。其次有24个下调表达的DEG显著富集于类胡萝卜素合成通路(carotenoid biosynthesis,K09840),包括类胡萝卜素合成通路上关键的限速酶PSY(3个DEG), 参与类胡萝卜素生物合成及代谢的酶PDS(1个DEG)、ZDS(1个DEG)、ZEP(2个DEG)、AAO3(1个DEG)以及NCED(2个DEG)[19, 21, 22]。其次,下调表达的DEG也显著富集到光合作用天线蛋白(photosynthesis-antenna proteins, K08912)和光合作用(photosynthesis, K14332)等与光信号相关的通路,以及植物昼夜节律(circadian rhythm-plant,K12120)(图9)中。综合GO和KEGG分析结果,发现DEG无论上/下调表达,都能够富集到多种与光信号和昼夜节律相关的通路,因此推测光照条件和昼夜节律可能是BnaC3.CCD4转基因材料白天花色变化的关键因素。
Fig. 9 KEGG Enrichment of down-regulated differentially expressed genes in the transcriptomes of BnaC3.CCD4 transgenic lines

图9 BnaC3.CCD4转基因材料转录组下调差异表达基因KEGG富集

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2.6 差异倍数显著的DEG的GO和KEGG富集分析

将差异倍数前50的DEG进行GO功能注释,结果表明在生物学过程中,DEG主要注释在细胞过程(16个DEG)、刺激响应(15个DEG)、代谢过程(15个DEG)、生物调节(8个DEG)和昼夜节律(6个DEG)方面;在细胞组分中,DEG主要注释到细胞(31个DEG)、细胞器(28个DEG)和细胞膜(20个DEG)组分;在分子功能中,则主要注释到结合(19个DEG)和催化活性(16个DEG)。通过GO富集分析表明,这些DEG显著富集在25个terms,如昼夜节律(circadian rhythm,GO:0007623)、铜离子胁迫响应(stress response to copper ion,GO:1990169)、衰老相关液泡(senescence-associated vacuole,GO:0010282)、节律过程(rhythmic process,GO:0048511)及昼夜节律的调节(regulation of circadian rhythm,GO:0042752)等(图10)。
Fig. 10 GO enrichment of the top-50 differentially expressed genes in the transcriptomes of BnaC3.CCD4 transgenic lines

图10 BnaC3.CCD4转基因材料转录组差异倍数前50差异表达基因GO富集

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进一步KEGG富集分析表明,DEG显著富集在植物昼夜节律(circadian rhythm-plant,K12120)和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis,K05359)(图11)。结合GO和KEGG的分析结果,DEG均富集到昼夜节律相关的通路,其中包括差异倍数最高的HY5基因。
Fig. 11 KEGG enrichment of the top-50 differentially expressed genes in the transcriptomes of BnaC3.CCD4 transgenic lines

图11 BnaC3.CCD4转基因材料转录组差异倍数前50差异表达基因KEGG富集

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2.7 与光信号调控相关的DEG

通过前期对6891个DEG进行GO和KEGG富集分析,发现上/下调DEG均显著富集到昼夜节律、植物激素和多条与光信号相关的通路中。昼夜节律由地球自转产生,是植物生物钟的一种类型,而生物钟由输入途径、核心震荡器及输出途径三部分组成,其输入途径可以通过光受体接收光信号[23]
在昼夜节律通路上显著富集的DEG许多是受光信号调节的因子,如APRR1(3个DEG)、PIF1(1个DEG)、LHY(5个DEG)、CCA1(2个DEG)、HY5(4个DEG)、COP1(5个DEG)等,其中APRR1PIF1在P组中上调表达,LHY、CCA1、HY5COP1在P组下调表达。在上调表达的DEG中,APRR1是伪响应调节器PRR家族的成员,能够负向调控拟南芥生物钟的关键基因LHYCCA1的表达[24]PIF1是光敏色素作用因子,属于bHLH转录因子家族,其通过与G-box结合抑制PSY表达[19]。在下调表达的DEG中,HY5(4个DEG)为bZIP家族的转录因子,前人研究结果显示其能够与PSY启动子上的光响应原件G-box结合,促进类胡萝卜素的生物合成[19]。COP1是一种E3泛素连接酶,主要针对参与光形态发生的转录因子(HY5HYH等),使其蛋白泛素化或降解[25]

2.8 与类胡萝卜素合成代谢相关的DEG

我们前面的研究表明BnaC3.CCD4是通过裂解类胡萝卜素影响油菜花色的[9],因此进一步筛选类胡萝卜素合成及代谢通路上的DEG。结果表明,类胡萝卜素合成及代谢通路上共富集到28个DEG(图12),包括PSY(3个DEG)、PDS(1个DEG)、Z-ISO(1个DEG)、ZDS(1个DEG)、LCYE(1个DEG)、CYP97A3(1个DEG)、BCH (5个DEG)、VDE(2个DEG)、ZEP(2个DEG)、NCED(2个DEG)、AAO3(1个DEG)、BG1(2个DEG)、CYP707A (6个DEG),除Z-ISO、VDEAAO3外其余基因均在P组中显著下调表达,其中CYP97A3BHC参与了玉米黄质的生物合成过程;BCHVDE共同参与了新黄质的生物合成;ZEP参与了紫黄质生物合成;另外,NCEDAAO3则参与了脱落酸的生物合成,而BG1、CYP707A参与了脱落酸的生物降解。因此,类胡萝卜素生物合成相关基因整体的下调表达造成下午BnaC3.CCD4转基因植株花瓣中类胡萝卜素含量的显著降低。
Fig. 12 DEG enriched in carotenoid biosynthesis and metabolic pathways
Note: Red indicates up-regulated DEG, green indicates down-regulated DEG, and blue indicates no down-regulated DEG

图12 类胡萝卜素生物合成及代谢途径富集的DEG

注:红色表示上调DEG,绿色表示下调DEG,蓝色表示无上下调DEG

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2.9 DEG的PPI 网络

用STRING 数据库对6891个DEG进行蛋白相互作用分析,得到的PPI网络互作图包含954个蛋白质,存在3912个互作关系,再通过CyToscape软件筛选出BC值前50的hub基因 [26]。结果如图13, 在分值前10的hub基因中,APRR1(3个DGE)分值最高,其均在P组中上调表达,前人研究表明APRR1基因的表达受昼夜节律影响,从黎明到黄昏不断升高[27]。而RCA(3个DGE)和HYH (4个DGE)与光信号有关,其在P组中均下调表达,RCA通过激活Rubisco来调节光合作用,在植物生长发育中不可或缺[28],而HYHHY5的同源基因,其表达也受到光信号的调节。另外,ZEP(2个DGE)和PSY(3个DGE)基因属于类胡萝卜素生物合成通路,其在P组中均下调表达。
Fig. 13 PPI network diagram of hub genes with top-50 BC values in the DEGs
Note: the size of the circle represents the size of the score. A larger circle indicates a higher score, while a smaller circle indicates a lower score

图13 分值前50的hub基因的PPI网络图

注:圆形大小代表分值的大小,越大表示分值高,越小表示分值越低

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将PPI网络中DEG进行KEGG富集分析,发现在真核生物的核糖体生物发生(ribosome biogenesis in eukaryotes,K14567)中富集到的DEG在P组中趋于上调表达;而在花色相关的类胡萝卜素生物合成(carotenoid biosynthesis,K09840)富集的DEG在P组中趋于下调表达;在淀粉和蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism,K16055)以及光合作用生物的碳固定(carbon fixation in photosynthetic organisms,K01100)等碳水化合物相关途径富集的DEG也在P组趋于下调表达。其余部分DEG则富集到植物昼夜节律(circadian rhythm-plant,K12120)和植物激素信号转导(plant hormone signal transduction,K14146)的通路中(图14),推测可能是由于受到外界环境影响,使hub基因富集在这两个通路中。
Fig. 14 PPI network diagram of the KEGG pathways of enriched DEG
Note: Red indicates up-regulated DEG and green indicates down-regulated DEG

图14 DEG富集的KEGG通路的 PPI网络图

注:红色表示上调DEG,绿色表示下调DEG

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2.10 转录数据中关键基因qRT-PCR验证

为了验证转录组结果的准确性,本研究选取8个关键的DEG进行qRT-PCR实验(图15)。其中包括昼夜节律通路上的BnaA01G0246600WE3HY5)、BnaA03G0418400WEAPRR1)和BnaC07G0002700WEPIF1);类胡萝卜素生物合成及代谢通路上的BnaC02G0072000WEPSY)、BnaA06G0049800WEVDE)和BnaC05G0000200WEZ-ISO);植物激素脱落酸相关的BnaC09G0103900WE(ZEP)和BnaC01G0096600WE(CYP707A)。qRT-PCR实验结果显示,此8个DEG的表达水平与转录组结果呈现的趋势一致,表明转录组结果的真实性和可靠性。
Fig. 15 qRT-PCR validation for the transcriptome data in BnaC3.CCD4-transgenic lines
Note: the bar graph reflects the relative expression value of qRT-PCR; the broken line graph reflects the TPM value of the transcriptome data; Westar: the control cultivar; TG: the transgenic lines

图15 BnaC3.CCD4转基因株系转录组数据qRT-PCR验证

注:柱状图是qRT-PCR相对表达量;折线图是转录组数据TPM值

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3 讨论

研究表明,甘蓝型油菜的花色主要受到花瓣中类胡萝卜素含量的影响 [9]。CCD蛋白家族成员能够通过氧化裂解途径降解类胡萝卜素从而调控其含量[29],其中CCD4定位于质体,在植物的花和果实中行使其功能。在我们前期的研究中,甘蓝型油菜的CCD4有4个拷贝, 其中BnaC3CCD4拷贝是甘蓝型油菜的白花基因,由于该基因的编码区存在转座子的插入导致基因失活,因此油菜花色呈现黄色[9]。在本研究中野生型BnaC3.CCD4转基因白花株系在同一天的上午和下午呈现出不同花色,在9:30为浅黄色,14:30时才呈现为纯白色。结果显示BnaC3.CCD4株系花瓣中类胡萝卜素的含量具有显著降低的趋势。KEGG分析显示,有24个表达量下降DEG显著富集在类胡萝卜素生物合成通路,表明该通路的下调可能是BnaC3.CCD4转基因株系白天花色的变化的主要原因。
进一步通过转录组数据的分析,发现部分的DEG在GO和KEGG中显著富集在生物钟相关的昼夜节律通路以及与光照相关的光信号转导等通路。前人研究发现,生物钟的输入途径可以通过光受体接受光信号[23]。本研究中显著富集在昼夜节律通路的APRR1、ELF3、CCA1、HY5、PIF1等基因同时也显著富集在光信号相关通路,因此推测光照是调控BnaC3.CCD4转基因株系花色变化的重要环境因素。另外,由于HY5PIF1能够与类胡萝卜素合成途经上的关键基因PSY启动子上的G-box结构域结合,且两者的表达受到温度的影响。在温度降低的条件下,HY5蛋白含量显著增加, 相反PIF1蛋白含量会显著减少[19]。在本研究中,P组的PIF1显著上调表达,而HY5PSY显著下调表达。因此推测从上午到下午外界环境中光温条件的变化影响了转录因子HY5PIF1基因的表达,两者共同调控PSY基因的下调表达,从而降低了转基因株系花瓣中的类胡萝卜素含量,使花色变为纯白。
叶黄素循环是去环氧的玉米黄素(Zeaxanthin,Z)、环氧玉米黄素(Antheraxanthin,A)和紫黄质(Violaxanthin,V)三种类胡萝卜素在不同光强下相互转化的通路,ZEP和VDE介导了该循环体系(图12)。据前人研究,强光条件下VDE催化V转化为A,A再一步脱环氧化为Z,而光强下降时Z则反向转化为V[30, 31]。因此推测,在本研究中,由于14:30时的光照强度比9:30强,所以P组中 VDE基因显著上调表达而ZEP基因显著下调表达。 另外,P组中脱落酸合成通路上的AAO3基因上调表达,脱落酸降解通路上BG1、CYP707A基因下调表达,结合前人研究,推测P组脱落酸的含量可能也受到光信号影响而升高,需要进一步检测花瓣中内源ABA的含量进行证实。

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