向日葵柄锈菌效应蛋白的预测及筛选

doi:10.19802/j.issn.1007-9084.2020278

摘要/Abstract

摘要：

向日葵柄锈菌（Puccinia helianthi Schw.）引发向日葵锈病，对生产具有破坏性。为深入了解锈菌效应蛋白，研究病原与寄主的互作机理，在获得向日葵柄锈菌分泌蛋白组的基础上，利用生物信息学软件预测及分析向日葵柄锈菌效应蛋白，采用qRT-PCR检测其中7个候选效应蛋白基因在接种叶片中的相对表达量。结果表明：在供试的900个锈菌的分泌蛋白中预测到候选效应蛋白497个。基因特征分析显示，开放阅读框长度在200～399 bp之间的最多；信号肽长度集中在16～27个氨基酸残基（占92.96%）；信号肽氨基酸组成中亮氨酸出现频率最高，其次为丙氨酸、异亮氨酸；信号肽识别位点以SpⅠ型为主。本研究获得了7个向日葵柄锈菌的效应蛋白，qRT-PCR检测表明柄锈菌接种向日葵叶片后，与纯孢子相比，这7个效应蛋白编码基因均上调表达，说明其参与了锈菌侵染向日葵的过程。

关键词: 向日葵柄锈病, 生物信息学, 效应蛋白, qRT-PCR

Abstract:

Puccinia helianthi Schw. is an important pathogenic fungi for sunflower. To better understand their pathogen-plant interacting, rust-effectors were predicted from secreted proteome of this sunflower rust pathogen. Among 900 secretory proteins, 497 candidate effectors were predicted. Protein characteristics showed that their length of open reading frame was mostly between 200 and 399 bp. Length of signal peptides were mainly （92.96%） between 16 and 27 amino acids.The most frequent amino acid in signal peptides was leucine, followed by alanine and isoleucine. Signal peptide recognition sites were mainly SpⅠ type. qRT-PCR on 7 candidate effector-encoding genes in inoculated leaves showed that they were up-regulated compared with pure spores （control）, indicating their involving in pathogenesis of sunflower rust.

Key words: Puccinia helianthi Schw., bioinformatics, effector, qRT-PCR

中图分类号:

S432.2

连小雨, 王妍, 路妍, 景岚. 向日葵柄锈菌效应蛋白的预测及筛选[J]. 中国油料作物学报, 2021, 43(6): 1141-1149.

Xiao-Yu LIAN, Yan WANG, Yan LU, Lan JING. Prediction and screening of effector proteins of Puccinia helianthi[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2021, 43(6): 1141-1149.

图/表 7

表1

图1

图2

图3

图4

表2

图5

参考文献 49

1	Putt E D， Sackston W E. Studies on sunflower rust： I. Some sources of rust resistance［J］. Can J Plant Sci， 1957， 37（1）： 43-54. DOI：10.4141/cjps57-005. doi: 10.4141/cjps57-005
2	路妍，刘洋，宋阳，等. 向日葵NBS-LRR抗病基因家族全基因组分析［J］. 中国油料作物学报， 2020， 42（3）： 441-452. DOI：10.19802/j.issn.1007-9084.2019243. doi: 10.19802/j.issn.1007-9084.2019243
3	Jones J D G， Dangl J L. The plant immune system［J］. Nature， 2006， 444（7117）： 323-329. DOI：10.1038/nature05286. doi: 10.1038/nature05286
4	戚拓. 条锈菌重要致病因子PstGSRE1和PstCPK1致病机理研究及利用HIGS技术创制小麦持久抗条锈病材料［D］. 杨凌：西北农林科技大学， 2018.
5	严霞，牛晓磊，陶均. 病原菌诱发的植物先天免疫研究进展［J］. 分子植物育种， 2018， 16（3）： 821-831. DOI：10.13271/j.mpb.016.000821. doi: 10.13271/j.mpb.016.000821
6	Jones D A， Bertazzoni S， Turo C J， et al. Bioinformatic prediction of plant-pathogenicity effector proteins of fungi［J］. Curr Opin Microbiol， 2018， 46： 43-49. DOI：10.1016/j.mib.2018.01.017. doi: 10.1016/j.mib.2018.01.017
7	Prasad P， Savadi S， Bhardwaj S C， et al. Rust pathogen effectors： perspectives in resistance breeding［J］. Planta， 2019， 250（1）： 1-22. DOI：10.1007/s00425-019-03167-6. doi: 10.1007/s00425-019-03167-6
8	何艳秋，颜瑞，蒙姑，等. 香蕉枯萎病菌1号小种分泌蛋白与效应子的预测与分析［J］. 植物病理学报， 2020， 50（2）： 129-140. DOI：10.13926/j.cnki.apps.000458. doi: 10.13926/j.cnki.apps.000458
9	范春霞，王军节，赵鲁迺克，等. 甜瓜粉霉病菌效应蛋白编码基因的预测与分析［J］. 植物病理学报， 2020， 8（3）： 1–14. DOI：10.13926/j.cnki.apps.000465. doi: 10.13926/j.cnki.apps.000465
10	Zhao S， Shang X， Bi W， et al. Genome-wide identification of effector candidates with conserved motifs from the wheat leaf rust fungus Puccinia triticina［J］. Front Microbiol， 2020， 11： 1188. DOI：10.3389/fmicb.2020.01188. doi: 10.3389/fmicb.2020.01188
11	Stergiopoulos I， de Wit P J G M. Fungal effector proteins［J］. Annu Rev Phytopathol， 2009， 47（1）： 233-263. DOI：10.1146/annurev.phyto.112408.132637. doi: 10.1146/annurev.phyto.112408.132637
12	Azizi P， Rafii M Y， Abdullah S N A， et al. Toward understanding of rice innate immunity against Magnaporthe oryzae［J］. Crit Rev Biotechnol， 2016， 36（1）： 165-174. DOI：10.3109/07388551.2014.946883. doi: 10.3109/07388551.2014.946883
13	Ghanbarnia K， Fudal I， Larkan N J， et al. Rapid identification of the Leptosphaeria maculans avirulence gene AvrLm2 using an intraspecific comparative genomics approach［J］. Mol Plant Pathol， 2015， 16（7）： 699-709. DOI：10.1111/mpp.12228. doi: 10.1111/mpp.12228
14	陈琦光，舒灿伟，杨媚，等. 植物病原真菌效应分子的研究进展［J］. 基因组学与应用生物学， 2016， 35（11）： 3105-3114. DOI：10.13417/j.gab.035.003105. doi: 10.13417/j.gab.035.003105
15	Aime M C， McTaggart A R， Mondo S J， et al. Phylogenetics and phylogenomics of rust fungi［M］//Fungal Phylogenetics and Phylogenomics. Amsterdam： Elsevier， 2017： 267-307. DOI：10.1016/bs.adgen.2017.09.011. doi: 10.1016/bs.adgen.2017.09.011
16	Jing L， Guo D D， Hu W J， et al. The prediction of a pathogenesis-related secretome of Puccinia helianthi through high-throughput transcriptome analysis［J］. BMC Bioinform， 2017， 18（1）： 1-13. DOI：10.1186/s12859-017-1577-0. doi: 10.1186/s12859-017-1577-0
17	Saunders D G O， Win J， Cano L M， et al. Using hierarchical clustering of secreted protein families to classify and rank candidate effectors of rust fungi［J］. PLoS One， 2012， 7（1）： e29847. DOI：10.1371/journal.pone.0029847. doi: 10.1371/journal.pone.0029847
18	Sperschneider J， Williams A H， Hane J K， et al. Evaluation of secretion prediction highlights differing approaches needed for oomycete and fungal effectors［J］. Front Plant Sci， 2015， 6： 1168. DOI：10.3389/fpls.2015.01168. doi: 10.3389/fpls.2015.01168
19	Hacquard S， Joly D L， Lin Y C， et al. A comprehensive analysis of genes encoding small secreted proteins identifies candidate effectors in Melampsoralarici-Populina （poplar leaf rust）［J］. Mol Plant-Microbe Interact， 2012， 25（3）： 279-293. DOI：10.1094/mpmi-09-11-0238. doi: 10.1094/mpmi-09-11-0238
20	Jorda J， Kajava A V. T-REKS： identification of tandem repeats in sequences with a K-meanS based algorithm［J］. Bioinformatics， 2009， 25（20）： 2632-2638. DOI：10.1093/bioinformatics/btp482. doi: 10.1093/bioinformatics/btp482
21	Nguyen Ba A N， Pogoutse A， Provart N， et al. NLStradamus： a simple Hidden Markov Model for nuclear localization signal prediction［J］. BMC Bioinformatics， 2009， 10： 202. DOI：10.1186/1471-2105-10-202. doi: 10.1186/1471-2105-10-202
22	董章勇，陈欣瑜，舒永馨，等. 茄子枯萎病菌致病效应因子的预测分析［J］. 西南农业学报， 2019， 32（6）： 1285-1289. DOI：10.16213/j.cnki.scjas.2019.6.013. doi: 10.16213/j.cnki.scjas.2019.6.013
23	Petersen T N， Brunak S， von Heijne G， et al. SignalP 4.0： discriminating signal peptides from transmembrane regions［J］. Nat Methods， 2011， 8（10）： 785-786. DOI：10.1038/nmeth.1701. doi: 10.1038/nmeth.1701
24	Juncker A S， Willenbrock H， von Heijne G， et al. Prediction of lipoprotein signal peptides in Gram-negative bacteria［J］. Protein Sci， 2003， 12（8）： 1652-1662. DOI：10.1110/ps.0303703. doi: 10.1110/ps.0303703
25	王妍. 基于向日葵锈菌转录组数据的SNP位点挖掘及效应因子的筛选［D］. 呼和浩特：内蒙古农业大学， 2018.
26	Song Y， Wang Y， Guo D D， et al. Selection of reference genes for quantitative real-time PCR normalization in the plant pathogen Puccinia helianthi Schw［J］. BMC Plant Biol， 2019， 19： 20. DOI：10.1186/s12870-019-1629-x. doi: 10.1186/s12870-019-1629-x
27	Schmittgen T D， Livak K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T） method［J］. Nat Protoc， 2008， 3（6）： 1101-1108. DOI：10.1038/nprot.2008.73. doi: 10.1038/nprot.2008.73
28	Milne T J， Abbenante G， Tyndall J D， et al. Isolation and characterization of a cone snail protease with homology to CRISP proteins of the pathogenesis-related protein superfamily［J］. J Biol Chem， 2003， 278（33）： 31105-31110. DOI：10.1074/jbc.m304843200. doi: 10.1074/jbc.m304843200
29	Liu J J， Sturrock R， Ekramoddoullah A K M. The superfamily of thaumatin-like proteins： its origin， evolution， and expression towards biological function［J］. Plant Cell Rep， 2010， 29（5）： 419-436. DOI：10.1007/s00299-010-0826-8. doi: 10.1007/s00299-010-0826-8
30	de Oliveira A L， Gallo M， Pazzagli L， et al. The structure of the elicitor Cerato-platanin （CP）， the first member of the CP fungal protein family， reveals a double ψβ-barrel fold and carbohydrate binding［J］. J Biol Chem， 2011， 286（20）： 17560-17568. DOI：10.1074/jbc.m111.223644. doi: 10.1074/jbc.m111.223644
31	Kulkarni R D， Kelkar H S， Dean R A. An eight-cysteine-containing CFEM domain unique to a group of fungal membrane proteins［J］. Trends Biochem Sci， 2003， 28（3）： 118-121. DOI：10.1016/s0968-0004（03）00025-2. doi: 10.1016/s0968-0004（03）00025-2
32	Catanzariti A M， Dodds P N， Lawrence G J， et al. Haustorially expressed secreted proteins from flax rust are highly enriched for avirulence elicitors［J］. Plant Cell， 2006， 18（1）： 243-256. DOI：10.1105/tpc.105.035980. doi: 10.1105/tpc.105.035980
33	Win J， Chaparro-Garcia A， Belhaj K， et al. Effector biology of plant-associated organisms： concepts and perspectives［J］. Cold Spring Harb Symp Quant Biol， 2012， 77： 235-247. DOI：10.1101/sqb.2012.77.015933. doi: 10.1101/sqb.2012.77.015933
34	高金欣，高士刚，李雅乾，等. 玉米弯孢叶斑病菌全基因组分泌蛋白的预测与分析［J］. 植物保护学报， 2015， 42（6）： 869-876. DOI：10.13802/j.cnki.zwbhxb.2015.06.002. doi: 10.13802/j.cnki.zwbhxb.2015.06.002
35	Nemri A， Saunders D G O， Anderson C， et al. The genome sequence and effector complement of the flax rust pathogen Melampsora lini［J］. Front Plant Sci， 2014， 5： 98. DOI：10.3389/fpls.2014.00098. doi: 10.3389/fpls.2014.00098
36	Tobias L， Christian S， Ralf V T. Early insights into the genome sequence of Uromyces fabae［J］. Front Plant Sci， 2014， 5： 587. DOI： 10.3389/fpls.2014.00587. doi: 10.3389/fpls.2014.00587
37	Valent B， Khang C H. Recent advances in rice blast effector research［J］. Curr Opin Plant Biol， 2010， 13（4）： 434-441. DOI：10.1016/j.pbi.2010.04.012. doi: 10.1016/j.pbi.2010.04.012
38	李云锋，聂燕芳，王振中. 植物病原真菌分泌蛋白质组学研究进展［J］. 微生物学通报， 2015， 42（6）： 1101-1107. DOI：10.13344/j.microbiol.china.140608. doi: 10.13344/j.microbiol.china.140608
39	Duplessis S， Cuomo C A， Lin Y C， et al. Obligate biotrophy features unraveled by the genomic analysis of rust fungi［J］. PNAS， 2011， 108（22）： 9166-9171. DOI：10.1073/pnas.1019315108. doi: 10.1073/pnas.1019315108
40	Duplessis S， Spanu P D， Schirawski J. Biotrophic fungi （powdery mildews， rusts， and Smuts）［M］//The Ecological Genomics of Fungi. Hoboken， N J： John Wiley & Sons， Inc， 2013： 149-168. DOI：10.1002/9781118735893.ch7. doi: 10.1002/9781118735893.ch7
41	闫丽斌，肖淑芹，薛春生. 玉米大斑病菌全基因组候选效应分子的预测和分析［J］. 沈阳农业大学学报， 2017， 48（1）： 15-20. DOI：10.3969/j.issn.1000-1700.2017.01.003. doi: 10.3969/j.issn.1000-1700.2017.01.003
42	Godfrey D， Böhlenius H， Pedersen C， et al. Powdery mildew fungal effector candidates share N-terminal Y/F/W_xC-motif［J］. BMC Genom， 2010， 11（1）： 317. DOI：10.1186/1471-2164-11-317. doi: 10.1186/1471-2164-11-317
43	Sperschneider J， Gardiner D M， Dodds P N， et al. EffectorP： predicting fungal effector proteins from secretomes using machine learning［J］. New Phytol， 2016， 210（2）： 743-761. DOI：10.1111/nph.13794. doi: 10.1111/nph.13794
44	齐悦，张悦，李建嫄，等. 利用本氏烟筛选小麦叶锈菌效应蛋白［J］. 农业生物技术学报， 2020， 28（1）： 150-159. DOI：10.3969/j.issn.1674-7968.2020.01.015. doi: 10.3969/j.issn.1674-7968.2020.01.015
45	韩长志. 全基因组预测希金斯炭疽菌的候选效应分子［J］. 生物技术， 2015， 25（6）： 546-551. DOI：10.16519/j.cnki.1004-311x.2015.06.0108. doi: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2015.06.0108
46	de Jonge R， van Esse H P， Kombrink A， et al. Conserved fungal LysM effector Ecp6 prevents chitin-triggered immunity in plants［J］. Science， 2010， 329（5994）： 953-955. DOI：10.1126/science.1190859. doi: 10.1126/science.1190859
47	Gout L， Fudal I， Kuhn M L， et al. Lost in the middle of nowhere： the AvrLm1 avirulence gene of the dothideomycete Leptosphaeria maculans［J］. Mol Microbiol， 2006， 60（1）： 67-80. DOI：10.1111/j.1365-2958.2006.05076.x. doi: 10.1111/j.1365-2958.2006.05076.x
48	Benjamin P， Sophien K. How do filamentous pathogens deliver effector proteins into plant cells ？［J］. PLoS Biology， 2014， 12（2）： 1001801. DOI： 10.1371/journal.pbio.1001801. doi: 10.1371/journal.pbio.1001801
49	Sperschneider J， Dodds P N， Gardiner D M， et al. Advances and challenges in computational prediction of effectors from plant pathogenic fungi［J］. PLoS Pathog， 2015， 11（5）： e1004806. DOI：10.1371/journal.ppat.1004806. doi: 10.1371/journal.ppat.1004806

基因名称 Gene name	引物（5 '－3'） Primer （5 '－3'）	褪火温度 Tm/℃	扩增产物 /bp Amplified product
Cluster32378	F： ACGTAGCCATTCGAGTCCTT	62	169
Cluster32378	R： CATTCTTCTGCGGTTTATTGT	62	169
Cluster38252.seq.Contig1	F： GAATGGTCAGGGACTACACT	60	238
Cluster38252.seq.Contig1	R： AGGTTTAACCGAACTCTTGG	60	238
Cluster39758.seq.Contig1	F： ACTCTTGCTGCTCACTGGA	60	162
Cluster39758.seq.Contig1	R： GCTCGTTAGGATTGTGGATG	60	162
Cluster40966.seq.Contig1	F： TCTGCTCCACTGTACTTGTC	60	125
Cluster40966.seq.Contig1	R： TTATGTATGCTCCATCTTCTCA	60	125
Cluster17592	F： CTGAAGAAACAAAGGCAAGAG	62	120
Cluster17592	R： GATACACGAAGCGTCCCAAA	62	120
Cluster36818.seq.Contig1	F： TTGGTGCTTCTCAAACGATCC	60	194
Cluster36818.seq.Contig1	R： CTCCCTCCTTCAAACCCTCT	60	194
Cluster29163	F： ATATCCCAGGAAGCTTGCCA	63	136
Cluster29163	R： GTGGTGACCAAAGACTGAGACA	63	136
UBC	F： GTGGTGACCAAAGACTGAGACA	60	119
UBC	R： CGACAGTCAGCCAACCTACC	60	119

基因名称 Gene name	无结构域 No domain	SCR半胱氨酸含量 Cysteine（>3%）	含RCP RCP	基序 Motif	可能性 Probability
Cluster32378	√	9.9%	-	YxC FxC WxC	1.000
Cluster38252.seq.Contig1	√	12.07%	√	WxC	1.000
Cluster39758.seq.Contig1	√	8.13%	-	YxC FxC	1.000
Cluster40966.seq.Contig1	√	5.93%	-	YxC FxC	0.983
Cluster17592	√	7.97%	-	FxC WxC	1.000
Cluster36818.seq.Contig1	√	-	-	YxC FxC	0.994
Cluster29163	√	8.77%	-	LxAR YxC	1.000

[1]	李鹏祥, 唐桂英, 徐平丽, 朱洁, 单雷, 万书波. 花生线粒体型苹果酸脱氢酶基因AhMMDH1 的结构与表达分析[J]. 中国油料作物学报, 2020, 42(6): 1090-.
[2]	胡冬秀, 刘浩, 鲁清, 李海芬, 方加海, 梁炫强. 花生CONSTANS-Like（COL）家族基因的克隆与表达分析[J]. 中国油料作物学报, 2020, 42(5): 778-.
[3]	龚静, 路妍, 宋阳, 景岚. 向日葵锈病抗性相关microRNA的挖掘及其靶基因预测[J]. 中国油料作物学报, 2020, 42(4): 687-.
[4]	任婧瑶, 蒋春姬, 李新林, 张鹤, 金华, 于海秋. 花生1,3,4-三磷酸肌醇5/6激酶ITPK家族基因的鉴定和分析[J]. 中国油料作物学报, 2020, 42(3): 432-.
[5]	王俊皓，谢五洋，徐华祥，袁学顺，周莹，崔喜艳* . 大豆GmAAP 基因的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位[J]. 中国油料作物学报, 2019, 41(5): 705-.
[6]	袁淑培，张付贵，黄倩，程希，高桂珍，伍晓明*. 甘蓝型油菜及其二倍体祖先种COR413家族基因生物信息学分析[J]. 中国油料作物学报, 2019, 41(4): 507-.
[7]	吴健，周永明，王幼平* . 油菜与核盘菌互作分子机理研究进展[J]. 中国油料作物学报, 2018, 40(5): 721-.
[8]	姜焕焕，王　通，禹山林，陈明娜，王　冕，陈　娜，潘丽娟，祁佩时，迟晓元 . 花生14-3-3基因家族的生物信息学分析[J]. 中国油料作物学报, 2018, 40(4): 501-.
[9]	陈宇，李爽，陈立杰，王媛媛，朱晓峰，刘晓宇，段玉玺* . 抑制谷胱甘肽合成对大豆胞囊线虫发育的影响[J]. 中国油料作物学报, 2018, 40(2): 284-.
[10]	赵　辉，张春艳，文　艺，刘玉霞，刘新涛，倪云霞，王　飞，刘红彦*. 菜豆壳球孢侵染芝麻过程中内参基因的筛选[J]. 中国油料作物学报, 2017, 39(3): 393-.
[11]	孟德义，郭人铭，赵虎，徐庆华，杜洋，郝再彬，张达 . 矮秆大豆 SGF14h 结构和功能生物信息学预测和分析[J]. 中国油料作物学报, 2017, 39(2): 152-.
[12]	陈湘瑜，徐日荣，熊发前，唐兆秀? . 野生花生Hsp70基因家族的全基因组鉴定及生物信息学分析[J]. 中国油料作物学报, 2016, 38(5): 572-.
[13]	马立功，张匀华，孟庆林，刘志华，王志英 . 向日葵查尔酮合酶HaCHS基因的克隆与逆境应答[J]. 中国油料作物学报, 2016, 38(01): 19-.
[14]	郭燕，詹高淼，杨晓燕，华玮，吕应堂* . 拟南芥叶片和角果特异性启动子的筛选与分析[J]. 中国油料作物学报, 2015, 37(1): 1-.
[15]	陈夕军，张磊，陈羽，张家豪，童蕴慧，徐敬友* . 油菜Bnpgip2-1基因的克隆表达与生物信息学分析[J]. 中国油料作物学报, 2014, 36(6): 701-.