北方白菜型冬油菜BrFLC家族的全基因组鉴定、克隆及表达分析

姚彦林, 马骊, 刘丽君, 李学才, 李鹏, 王旺田, 蒲媛媛, 牛早霞, 徐芳, 孙万仓, 武军艳

中国油料作物学报 ›› 2023, Vol. 45 ›› Issue (1) : 83-94.

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中国油料作物学报
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中国油料作物学报 ›› 2023, Vol. 45 ›› Issue (1) : 83-94. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2021314
种质资源·遗传育种

北方白菜型冬油菜BrFLC家族的全基因组鉴定、克隆及表达分析

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Genome-wide identification, cloning and analysis of BrFLC family in northern winter rapeseed （Brassica rapa）

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本文亮点

春化过程是冬性植物抽薹开花前的主要阶段。FLC（FLOWERING LOCUS C）基因在春化过程中可以整合上游信号调控植物开花。为了解白菜型冬油菜中FLC基因的特征及其春化功能，以6个拟南芥FLC基因为索引从白菜型冬油菜基因组中鉴定得到10个BrFLC基因，其中8个均含有7个外显子。10个BrFLC分布于4条染色体上，存在明显的基因复制现象。进化及保守结构分析显示聚为一类的成员蛋白质保守Motif分布相似。基因上游1500 bp的启动子区域均含有光应答元件，其中BrFLC4、BrFLC5和BrFLC6含低温响应元件，BrFLC3、BrFLC4、BrFLC7、BrFLC9含激素响应元件。比对发现，位于A02上的BrFLC6基因序列与大白菜中已注释的Bra031886差异性较大。克隆到陇油6号、陇油17、天油2号和天祝小油菜中的BrFLC6基因，序列相似性达99.5%。分析其中序列差异最大的BrFLC6基因，qRT-PCR检测发现它可在根、茎、叶、花蕾及花中表达；春化处理后则表达下调，不同品种间下调幅度有差异。结合春化率的观察，认为春化过程抑制了BrFLC6的表达，且基因表达水平与白菜型冬油菜通过春化所需的时间有关。

HeighLight

Vernalization is the main stage of bolting and flowering of winter plants, FLC （FLOWERING LOCUS C） integrates upstream signals to regulate flowering during vernalization. To understand the characteristics of FLC genes in winter rapeseeds （B. rapa） and its function in vernalization, 10 BrFLCs were identified from winter rapeseed genome using 6 Arabidopsis FLC genes as queries, 8 of which contained 7 exons. 10 BrFLCs are distributed on 4 chromosomes with obvious gene duplications. Evolutionary and conserved structure analysis showed that members in the same class were clustered with similar protein conserved motif distributions. The 1500 bp upstream promoter region of all the genes contained light response elements, among which BrFLC4, BrFLC5 and BrFLC6 contained low temperature response elements, and BrFLC3, BrFLC4, BrFLC7 and BrFLC9 contained hormone response elements. BrFLC6 gene sequence located on A02, it was quite different from the annotated Bra031886 in B. rapa. Thus weconsequently cloned the BrFLC6 genes from Longyou 6, Longyou 17, Tianyou 2, and Tianzhu small rape, and found that their sequence alignment similarity reached 99.5%. By analyse the BrFLC6 gene with the greatest sequence difference, qRT-PCR detection showed that could be expressed in roots, stems, leaves, flower buds and flowers. BrFLC6 showed a down-regulation trend after vernalization, but the down-regulation extent was different among cultivars. Combined with the vernalization rate, it indicated that vernalization process might inhibited BrFLC6 expression, and its expression level was related to the time required by winter rapeseeds to pass through vernalization.

关键词

白菜型冬油菜 / FLC转录因子 / 生物信息学分析 / 基因克隆 / 表达分析

Key words

winter rapeseeds / FLC transcription factor / bioinformatics analysis / gene clone / expression analysis

引用本文

EndNote

Ris (Procite)

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姚彦林 , 马骊 , 刘丽君 , 李学才 , 李鹏 , 王旺田 , 蒲媛媛 , 牛早霞 , 徐芳 , 孙万仓 , 武军艳. 北方白菜型冬油菜BrFLC家族的全基因组鉴定、克隆及表达分析[J]. 中国油料作物学报, 2023, 45(1): 83-94 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2021314
Yan-lin YAO , Li MA , Li-jun LIU , Xue-cai LI , Peng LI , Wang-tian WANG , Yuan-yuan PU , Zao-xia NIU , Fang XU , Wan-cang SUN , Jun-yan WU. Genome-wide identification, cloning and analysis of BrFLC family in northern winter rapeseed （Brassica rapa）[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2023, 45(1): 83-94 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2021314
中图分类号： S565.4   
白菜型冬油菜具有优异的抗寒性，易栽培管理，目前是我国北方地区主要的越冬类油料生态作物[1]。北方地区因海拔、纬度等影响，冬季极端温度低，油菜在整个生育期必须经历春化过程才能进入生殖生长完成抽薹开花。在农业生产中，冬油菜耐低温，返青迟，生育期较长，给育种带来了负面影响。因此研究白菜型冬油菜的春化作用及相应的开花调控基因，对筛选适宜于北方地区种植、具有早花性状的抗寒性品种具有重要意义。
FLC（FLOWERING LOCUS C）基因是一类对植物开花发挥重要作用的转录因子，主要通过与SVP共同作用来抑制开花调控网络中的下游基因FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1（SURPRESSER OF CONSTANS 1）的表达最终调控植物开花[2,3]。研究发现：FLC基因编码一种MADS-box转录因子，在调控植物开花过程中发挥重要作用，低温通过抑制MADS-box的表达从而促使植物开花[4]。通过对拟南芥的研究表明，FLC基因的表达量高时，会明显抑制植株开花，致使FLC基因的功能突变体植株出现早花现象[5]。随着对FLC基因不断深入的研究，与FLC同源的基因在不同物种中被成功鉴定与分析，在拟南芥[6]中发现6个FLC基因，甘蓝型油菜[7]中15个，杨树[8]中13个，油莎草[9]中4个，萝卜[10]中5个，FLC基因的功能研究[11]发现FLC及其同源基因都参与了花期调控。
MADS-box转录因子家族分为TypeⅠ型和TypeⅡ型，TypeⅡ型又被划分为MIKCC和MIKC*型，FLC基因是该家族中TypeⅡ型里面MIKCC型的一个亚家族。近些年伴随MADS-box转录因子在不同物种中的鉴定，不同物种中FLC亚家族的成员数目也清晰化，但在白菜型冬油菜中关于FLC家族基因至今未研究。因此本文利用甘肃农业大学最新测序的白菜型冬油菜基因组数据，研究了BrFLC家族基因的结构特征，在感温性不同的油菜中，结合大白菜中已注释的BraFLC，分析了其中序列差异最大的BrFLC6基因在春化处理中的表达特性，同时结合转录组数据，揭示BrFLC6蛋白对春化作用的响应模式，为白菜型冬油菜开花的分子机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与数据来源

本实验中所用的材料见表1，使用的大白菜全基因组数据下载于Ensembl网站（http://plants.ensembl.org/index.html），白菜型油菜全基因组数据来自于甘肃农业大学最新测序结果，拟南芥蛋白序列下载于（http://www.arabidopsis.org/）数据库、甘蓝型油菜蛋白序列来自已发表的研究成果[12]。
表1 材料及来源地

Table 1 Experimental materials and their origins

材料名称

Material

感温性

Temperature sensitivity

材料来源

Origin

陇油6号

Longyou 6

强冬性

Strong winterness

甘肃农业大学农学院

College of Agriculture， Gansu Agricultural University

陇油7号

Longyou 7

强冬性

Strong winterness

甘肃农业大学农学院

College of Agriculture， Gansu Agricultural University

天祝小油菜

Tianzhu small rape

春性

Springness

甘肃农业大学农学院

College of Agriculture， Gansu Agricultural University

陇油17号

Longyou 17

冬性

Winterness

甘肃农业大学农学院

College of Agriculture， Gansu Agricultural University

天油2号

Tianyou 2

冬性

Winterness

天水农科所

Tianshui Agricultural Science Institute

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

以拟南芥的MADS-box基因蛋白序列为索引与白菜型冬油菜基因组蛋白序列进行Blast比对，基于拟南芥MADS-box基因蛋白序列构建了隐马尔科夫模型用来搜索候选基因，将所获得的蛋白序列提交至SMART：（https://www.omicsclass.com/article/）和NCBI CDD：（https://www.omicsclass.com/article/）网站做蛋白结构预测，以验证序列，结合进化分析最终确定BrFLC基因家族成员。参照赵玉红等[13]方法分析各成员的蛋白理化性质，利用MEGA软件对白菜型冬油菜、甘蓝型油菜、拟南芥、大白菜FLC蛋白序列进行多序列比对并构建系统进化树[14,15]。通过在线工具MEME（http://meme-suite.org/） 分析各成员的保守Motif。利用perl脚本从白菜型冬油菜基因组gff文件中获取BrFLC基因在染色体上的位置信息，结合染色体的名称、长度信息通过软件Mapchart绘制BrFLC基因染色体分布图。运用MCScanX软件分析基因共线性关系，并通过circos进行美化处理。提取基因上游1500 bp区域作为启动子区，利用在线软件Plantcare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测启动子区调控元件[16]。

1.2.2 材料处理

选取陇油6号、陇油7号、陇油17、天油2号、天祝小油菜籽粒饱满的种子，种子萌发参照马骊等[17]方法。待种子露白后将天祝小油菜种植于营养钵，待到始蕾期取根、茎、叶、花蕾，初花期取花并液氮速冻，之后放于-80℃冰箱用于检测基因在不同组织中的表达。将陇油6号、陇油7号、陇油17、天油2号露白后的种子置于低温培养箱（4℃ 16 h光照 / 8 h黑暗）开始春化处理，处理时间为20 d、30 d、40 d、50 d、60 d、70 d，以0 d作为对照，取出植物材料，一部分种植于含有营养基质的花盆中用于春化率统计，一部分用清水冲洗干净，滤纸吸干植株水分，用锡箔纸包裹，置于-80℃超低温冰箱用于检测基因表达，实验设计3次重复。

1.2.3 基因克隆与表达分析

利用Primer5.0软件设计克隆引物（表2），提取常温下陇油6号、陇油7号、陇油17、天油2号、天祝小油菜、Lenox（弱抗寒品种）生长锥的RNA，以反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后参照TIANGEN（天根生化科技公司）的DNA纯化回收试剂盒说明书进行纯化，纯化产物与pMD19-T克隆载体连接，再与DH5α感受态混匀培养，挑取白斑进行菌液PCR验证，筛选阳性克隆送上海生工测序。根据测序结果设计荧光定量引物（表2，其中Actin为内参基因），引物合成由上海生工完成。以不同感温性冬油菜春化处理中植株的cDNA，天祝小油菜始蕾期根、茎、叶、花蕾及初花期时花的cDNA为模板进行qRT-PCR反应，每个处理时间3个生物学重复。通过公式2-△△CT计算基因相对表达量，利用SPSS22.0分析显著性，作图采用Origin2021。
表2 引物序列

Table 2 Primer sequence

引物名称

Primer

引物序列（5'→3'）

Primer sequence （5'→3'）

引物用途

Usage
BrFLC6-F ATGGGAAGAAGAAAAGTGGAGATCAAACG

基因克隆

Gene clone

BrFLC6-R TTACTTTAGGAGCGGGAGGGTC
L6-BrFLC6-F AGTCCAGTGCAAGTGTGAAGAAGC

实时荧光定量PCR

Real-time fluorescence quantitative PCR

L6-BrFLC6-R AGTTACAGACAGAGCAGCCTTGAAC
L7-BrFLC6-F AGTCCAGTGCAAGTGTGAAGAAGC

实时荧光定量PCR

Real-time fluorescence quantitative PCR

L7-BrFLC6-R AGTTACAGACAGAGCAGCCTTGAAC
TZ-BrFLC6-F AGTCCAGTGCAAGTGTGAAGAAGC

实时荧光定量PCR

Real-time fluorescence quantitative PCR

TZ-BrFLC6-R AGTTACAGACAGAGCAGCCTTGAAC
Actin-F TGTGCCAATCTACGAGGGTTT

实时荧光定量PCR

Real-time fluorescence quantitative PCR

Actin-R TTTCCCGCTCGGCTGTTGT

2 结果与分析

2.1 白菜型冬油菜BrFLC家族成员的鉴定及蛋白理化性质分析

在白菜型冬油菜中获得了10个BrFLC（表3），结合已注释的大白菜的FLC基因，将这10个基因分别命名为BrFLC1~BrFLC10.蛋白BrFLC的氨基酸长度在192~358之间，分子量为21.50~39.68 kD，蛋白质的理论等电点除BrFLC1、BrFLC4和BrFLC5外均大于7，说明该家族含有大量的碱性氨基酸。除BrFLC1、BrFLC2和BrFLC10的蛋白不稳定系数小于40，其余均大于40，因此该家族蛋白多为不稳定蛋白。蛋白质的亲水性均小于0，说明BrFLC均为亲水性蛋白。BrFLC蛋白均由α螺旋、β折叠、无规则卷曲和延伸链组成，其中α螺旋在10条BrFLC蛋白中所占比例高于其它类型，其次为无规则卷曲，β折叠最低，由此可知α螺旋和无规则卷曲是该家族蛋白二级结构的主要组成部分。
表3 BrFLC基因家族成员基本信息

Table 3 Basic information of BrFLC gene family members

基因

Gene

 ID

氨基酸残基数

Amino acid

MW

/kD

 pI

不稳定系数

Unstable

coefficient

亲水性

Hydrophilicity

外显子

Exons

亚细胞定位

Subcellular localization

染色体定位

Chromosome location

大白菜同源基因

The homologous in B. rapa

α螺旋

α helix

/%

β折叠

β turn

/%

延伸链

Extended strand /%

无规则卷曲

Random coil

/%
BrFLC1 Brapa10T000598 197 22.06 6.01 39.66 -0.44 7 chlo 2 596 272~2 601 013 Bra009055 59.90 5.58 12.69 21.83
BrFLC2 Brapa02T000341 196 21.93 8.84 39.48 -0.47 7 Nucl 1 679 943-~1 683 538 Bra028599 65.82 4.59 12.76 16.84
BrFLC3 Brapa03T000416 197 21.59 9.23 40.59 -0.29 7 Nucl 1 810 239~1 813 678 Bra006051 60.41 4.06 12.18 23.35
BrFLC4 Brapa02T004660 192 21.50 6.22 58.14 -0.50 7 Cyto 41 089 227~41 093 400 Bra031888 59.90 5.21 11.98 22.92
BrFLC5 Brapa03T001557 196 22.00 5.53 42.09 -0.39 7 Nucl 7 593 279-~7 598 575 Bra022771 64.80 4.08 12.76 18.37
BrFLC6 Brapa02T004661 198 22.92 8.77 55.39 -0.68 7 Nucl 41 100 098~41 104 465 Bra031886 54.80 4.52 11.06 24.62
BrFLC7 Brapa06T002482 199 22.80 8.77 48.58 -0.46 7 Nucl 16 449 350~16 454 026 Bra024350 59.80 2.01 14.07 24.12
BrFLC8 Brapa06T002484 231 26.19 9.26 48.83 -0.38 7 Nucl 16 457 667~16 461 660 Bra024351 63.20 4.76 9.96 22.08
BrFLC9 Brapa02T004663 199 22.80 9.52 52.69 -0.56 8 Nucl 41 109 117~41 114 125 Bra031884 66.83 5.03 12.06 16.08
BrFLC10 Brapa10T000601 358 39.68 8.44 35.39 -0.26 9 Nucl 2 616 921~2 624 799 / 49.16 8.38 18.44 24.02

2.2 BrFLC蛋白的进化分析

以10个BrFLC、15个BnFLC、9个BraFLC、6个AtFLC的蛋白序列构建了系统进化树（图1），白菜型冬油菜、大白菜、甘蓝型油菜这3个物种的FLC家族成员相较于拟南芥亲缘关系更近，聚为3类，命名为Group 1~Group 3，其中Group 1共含有17个基因，包括5个BrFLC、7个BnFLC、4个BraFLC和1个AtFLC。Group 2包含基因数最多，共22个，5个BrFLC、7个BnFLC、5个BraFLC和5个AtFLC。Group 3只含有1个BnFLC基因，说明此基因在进化过程中保守性较高。进一步分析这些基因成员的聚类关系，发现序列相似度极高的都聚在了同一支，推测此类基因由共同的祖先进化而来，它们的基因功能相同或相似。
图1 白菜型冬油菜、甘蓝型油菜、大白菜、拟南芥FLC基因家族进化分析
注：Br：白菜型冬油菜；Bn:甘蓝型油菜；Bra：大白菜；At：拟南芥

Fig. 1 Evolution analysis of FLCgene family in winter rapeseed （Brassica rapa）, B. napus and Arabidopsis

Note: Br: Winter rapeseed; Bn: Brassica napus; Bra: Brassica rapa; At: Arabidopsis thaliana

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2.3 BrFLC蛋白保守基序及基因结构分析

由Motif分析结果可知（图2），BrFLC被分为3类，聚为一类的成员含有的保守基序相同或相似，motif1、motif2、motif3和motif4在所有基因序列中都存在。从每个基因所含保守基序的数目来看，BrFLC10基因含有的保守基序最多，BrFLC4和BrFLC8含有4个保守基序，其它成员均含有5个保守基序，初步推测每个基因所含保守基序数目的差异可能与基因功能分化有一定关系。通过进一步分析保守结构域发现，BrFLC编码的蛋白主要由MADS-Box、K-Box、I区、C末端四种结构域组成，其中位于N端高度保守的MADS-Box由50-60个氨基酸组成，该结构域能够被上游基因识别，而保守性相对较高的K-box结构域含有大约70个左右的氨基酸，该结构域对植物的开花调控具有一定的作用，I结构域和C结构域组成氨基酸数目不等，保守性相对较低。基因结构分析显示，BrFLC10基因不含有UTR，但具有的外显子数最多，含有9个外显子，BrFLC8含有8个外显子，其余基因均含有7个外显子。除BrFLC1和BrFLC5长度小于4000 bp，其余均大于4000 bp，BrFLC10基因最长，为8000 bp。
图2 白菜型冬油菜BrFLC的基因结构、保守Motif分析

Fig. 2 Gene structure and conservative motif analysis of BrFLC in winter rapeseeds （B. rapa）

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2.4 染色体定位及共线性分析

BrFLC基因主要分布于白菜型冬油菜A02、A03、A06和A10染色体上，其中A03、A06和A10染色体分别分布有两个基因，而A02染色体上最多，有4个基因（图3）。白菜型冬油菜物种内共线性分析表明（图4A），10个BrFLC基因存在5对共线性关系，其中A02、A03和A10染色体之间的共线性基因最多，含有4对，同时共线性基因存在单个基因对应多个基因的情况，说明该家族基因在进化过程中存在复制现象。10个BrFLC基因中，除3个BrFLC（1、4、5）外，其余7个成员与拟南芥AGL25、AGL31、AGL68存在共线性关系，8个BrFLC（2、3、5、6、7、8、9、10）与甘蓝型油菜A亚基因组上的8个基因、C亚基因组上的4个基因具有共线性关系（图4B）。进一步对三个物种间的同源基因进行统计，发现拟南芥中有3个FLC基因在白菜型冬油菜中有两个以上的同源基因，而白菜型冬油菜里面5个BrFLC基因在甘蓝型油菜中有两个以上的同源基因。表明物种进化过程中的复制现象是FLC基因扩增的主要原因。
图3 白菜型冬油菜染色体上BrFLC基因的分布

Fig. 3 Distribution of BrFLC genes on chromosomes of winter rapeseeds （B. rapa）

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图4 白菜型冬油菜BrFLC基因家族组内共线性关系以及与拟南芥、甘蓝型油菜共线性分析
注：A：背景区域为白菜型冬油菜基因组中的所有共线性部分，红色线条代表存在共线关系的BrFLC基因对，不同颜色的半圈代表染色体；B：灰色背景代表白菜型冬油菜与拟南芥、甘蓝型油菜基因组中的共线性区域，彩色线条代表与不同物种间存在共线性关系的FLC基因对

Fig. 4 Analysis of collinearity in BrFLC gene family of winter rapeseeds （B. rapa） and collinearity with Arabidopsis and B. napus

Note: A: background is all the collinearity parts in B. rapa genome; red lines represent contributing BrFLC gene pairs; half circles with different colors represent chromosomes. B: gray background represents the collinearity region in the genomes of winter rapeseeds （B. rapa）, Arabidopsis and B. napus; and the colored lines represent FLC gene pairs having collinearity relationship with different species

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图5 BrFLC基因顺式作用元件分析

Fig. 5 Analysis of cis-acting elements of BrFLC genes

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图6 BrFLC与大白菜FLC氨基酸序列比对分析

Fig. 6 Amino acid sequence alignment analysis ofBrFLCs and B. rapa FLCs

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图7 BrFLC6基因菌液PCR电泳产物

Fig. 7 PCR electrophoresis product of BrFLC6 gene

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图8 不同油菜品种BrFLC6基因氨基酸序列比对分析
注：L6：陇油6号l；L17：陇油17；T2：天油2号；TZ：天祝小油菜；L7：陇油7号

Fig. 8 Alignment analysis of amino acid sequence of BrFLC6 gene in different rape varieties

Note: L6: Longyou 6; L17: Longyou 17; T2: Tianyou 2; TZ: Tianzhu small rape; L7: Longyou 7

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图9 4℃处理下BrFLC基因在陇油7号和Lenox生长锥中的表达模式
注：Group A为陇油7号；Group B为Lenox （Lenox为弱抗寒性品种）

Fig. 9 Expression pattern of BrFLC genes in Longyou 7 and Lenox growth cone at 4℃

Note: Group A is Longyou 7; Group B is Lenox (weak cold-tolerance cultivar)

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图10 春化过程中BrFLC6基因的荧光定量表达

Fig. 10 Quantitative expression of BrFLC6 gene during vernalization

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2.5 启动子区顺式作用元件分析

启动子区富含各种类型的调控元件（图5），包括参与植物生长发育、光应答、激素响应的相关元件。分析每个基因所含元件类型，发现所有BrFLC均含有大量参与光反应的元件，另外BrFLC1、BrFLC3、BrFLC10含有参与调控胚乳生长的元件GCN4-moti和响应脱落酸反应的元件ABRE，BrFLC2和BrFLC6含有参与分生组织表达的元件CAT-box，BrFLC3、BrFLC4、BrFLC7、BrFLC9具有参与生长素和水杨酸反应的响应元件TGA-element、TATC-box，BrFLC4、BrFLC5、BrFLC6含有低温响应元件LTR。表明BrFLC基因可能在植物生长、激素反应和低温胁迫反应中具有重要作用。

2.6 白菜型冬油菜和大白菜FLC（BraFLC）氨基酸序列比对分析

BrFLC与BraFLC序列比对结果（图6）显示，3个BrFLC（2、5、9）分别与大白菜中Bra028599、Bra022771、Bra031884的氨基酸序列完全一致。BrFLC1与Bra009055相比序列较短；BrFLC3与Bra006051氨基酸存在一处不同；BrFLC4和BrFLC8与大白菜的Bra031888和Bra024351相似度最高，但序列长度不同，BrFLC4在第140个氨基酸处插入了14个氨基酸，BrFLC8在第181个氨基酸处插入了31个。BrFLC7与Bra024350的第46个氨基酸不同，并且在第153个氨基酸处插入了3个。BrFLC6与Bra031886相比差异较大，存在35处不同，另外在其第86个氨基酸处插入了一段长11个氨基酸的片段，在第102个氨基酸处缺失1个氨基酸、169~171之间缺失3个，从182个氨基酸开始提前终止57个。

2.7 白菜型冬油菜BrFLC6基因的克隆

克隆序列差异最大的BrFLC6，结果显示（图7）BrFLC6基因CDS长600 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码198个氨基酸。不同品种的BrFLC6序列比对分析表明，陇油6号中434 bp处发生了碱基突变，A突变为G，与陇油7号的相似性为99.83%；天祝小油菜中415 bp处发生碱基突变，A突变为G，与陇油7号的相似性为99.83%；陇油17、天油2号与陇油7号的序列完全一致。氨基酸序列分析表明，陇油6号和天祝小油菜的BrFLC6序列与陇油7号相似性为99.50%（图8）。

2.8 低温处理下白菜型冬油菜BrFLC基因的表达模式

取用8个BrFLC在陇油7号和Lenox中的表达分析（图9），结果表明在低温处理过程中，8个BrFLC表达各有不同，在强抗寒性品种陇油7号中，5个BrFLC（1、2、3、8、9）随处理时间的延长下调表达，其中BrFLC2下调最明显，3个BrFLC（4、5、7）表现为上调表达。当恢复24 h后，除BrFLC3和BrFLC5外，其余6个基因表达量上调，由此可推断低温抑制了BrFLC的表达。在弱抗寒性品种Lenox中除BrFLC2、BrFLC3和BrFLC5外，其余成员低温处理24 h的表达量均高于3 h，恢复24 h后，除BrFLC7外，其它7个基因均上调表达，且上调幅度比陇油7号更大，推断BrFLC的表达与品种的抗寒性有关。

2.9 春化过程中白菜型冬油菜BrFLC6的表达特性

检测BrFLC6基因在不同感温性白菜型冬油菜春化处理过程中的表达量表明，4℃春化处理后，该基因整体下调表达（图10），这与结果2.8的8个BrFLC在4℃处理过程中的转录组表达模式相近，但相同处理时间下不同品种中BrFLC6的表达下调幅度存在差异。春化处理30 d时，冬性品种天油2号下调幅度最大（图11），春化率统计结果也表明天油2号在春化处理30 d时其春化率达88.9%，而强冬性陇油6号和陇油7号春化率仅20%~40%（表2）。春化处理50 d，在陇油6号、陇油7号中基因表达下调幅度升高，春化率明显增加。陇油17在春化处理60 d后基因表达量下调幅度变小，春化率统计结果表明在处理60 d完全通过春化。表明BrFLC6的表达与品种的冬性强弱及春化时间有关。在不同组织中的表达显示，该基因在白菜型油菜根、茎、叶、花蕾和花中均表达（图12）。
图11 春化过程中BrFLC6基因表达量幅度变化

Fig. 11 Amplitude of BrFLC6 gene expression changes during vernalization

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图12 BrFLC6基因在天祝小油菜不同组织中的表达

Fig. 12 Expression of BrFLC6 gene in different tissues of Tianzhu small rape

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表4 不同春化时间对油菜春化率的影响

Table 4 Effect of different vernalization time on rape vernalization rate

时间

Time /d

 春化率 Vernalization rate

陇油6号

Longyou 6

陇油7号

Longyou 7

陇油17号

Longyou 17

天油2号

Tianyou 2
CK 0 0 0 0
20 15.6% 13.3% 23.2% 46.8%
30 26.6% 39.6% 46.7% 88.9%
40 40.0% 46.6% 73.3% 98.3%
50 73.3% 71.6% 93.3% 100%
60 86.1% 86.6% 96.7% 100%
70 95.4% 94.3% 97.1% 98.3%
注：春化率95%（包含95%）以上视为通过春化
Note: Vernalization rate of 95% （including 95%） or more is deemed to have passed vernalization

3 讨论

3.1 生物信息学分析为白菜型冬油菜BrFLC的基因特征提供了系统解释

FLC基因是植物生长发育重要的转录因子[18,19]，被广泛研究。在最原始的白菜组中克隆到4个FLC的同源基因[20~22]。本研究对甘肃农业大学测序获得的白菜型冬油菜基因组数据进行检索，共鉴定出10个BrFLC。基因结构的不同可能会影响基因功能，通常多个内含子的基因更为保守。生物信息学分析表明，BrFLC与大白菜BraFLC相比，除3个BrFLC（2、5、9）外，其余成员因所含核苷酸数目不同存在较大差异，BrFLC8和BrFLC10分别含7、8个内含子，其余8个BrFLC均由6个内含子构成，大白菜中与BrFLC5序列完全一致的Bra022771含有4个内含子，与BrFLC4序列相似度最高的Bra031888含有5个内含子，这表明进化过程中基因长度的增加或剪接方式的不同导致基因的结构更加复杂，内含子数目的增多使得BrFLC表现出高度的序列保守性。片段复制增加了基因数量，导致在进化过程易产生基因功能的分化。许多研究表明，白菜与拟南芥相比在进化过程中经历了全基因组复制事件[23]，而甘蓝型油菜是白菜与甘蓝自然加倍形成的异源四倍体[24,25]。本研究通过进化分析发现BrFLC与大白菜、甘蓝型油菜相应的同源基因结构相似，具有密切的系统发育关系，共线性分析也发现片段复制是导致BrFLC数量增加的主要原因，但在复制过程中存在丢失现象，可能这也是白菜型冬油菜BrFLC基因家族成员多于拟南芥少于甘蓝型油菜的主要原因，这些复制被保留下来的BrFLC在白菜型冬油菜进化过程中有些出现了序列差异，而基因序列的差异可能会影响到基因功能。

3.2 转录水平分析低温处理下不同抗寒性白菜型冬油菜中BrFLC的差异变化

在北方超强抗寒性白菜型冬油菜品种的选育中发现陇油系列更具优异的抗寒性，更耐低温，返青迟，返青后生长快[26]。已有研究[27,28]表明低温可以诱导两种非编码RNA的形成从而抑制FLC的表达。本研究发现低温（4℃）处理过程中，陇油7号响应更明显，随低温处理时间的延长，BrFLC逐渐下调表达，恢复低温后，上调幅度不大，表现出较强的耐寒性和适应性，Lenox对低温较敏感，响应较早，在处理早期就表现出抑制BrFLC的表达。杜春芳[29]对甘蓝型油菜研究发现，耐寒系品种对4℃低温胁迫响应较敏感系品种更迅速，这与杜春芳的研究结果相似。推断BrFLC的表达模式与不同抗寒性白菜型冬油菜响应低温的敏感性有关。

3.3 不同感温性冬油菜的春化率与BrFLC6在春化过程中的表达模式有关

孙万仓[30]等研究发现，白菜型冬油菜抗寒性强的品种其冬性也强。甘肃农业大学对白菜型冬油菜的多次春播试验发现[31]，冬性弱的品种通过春化的比例高。本研究选取了不同感温性冬油菜品种，通过4℃低温进行了种芽诱导春化，因参试品种的感温性差异，春化结果也表现出明显不同，没有春化的种子其植株春化率为0，伴随春化时间的延长，强冬性陇油6号、陇油7号春化率明显上升，需要通过春化的时间更长，相反冬性较弱的品种通过春化的时间短，说明白菜型冬油菜春化率与自身感温性有关。白菜型冬油菜中BrFLC6基因序列差异较大，在不同感温性冬油菜中的克隆结果表明，不同品种的感温性与BrFLC6的基因序列并无关系，可能不同感温性品种的春化率不受基因本身结构特征的影响。qRT-PCR分析发现春化处理过程中BrFLC6基因在不同感温性冬油菜品种中均呈下调表达趋势，这与拟南芥[32,33]中的表达模式类似，推断在春化处理中可能通过降低该基因的表达量来抑制蛋白活性，促使基因沉默，从而利于冬油菜抽薹开花。研究发现不同感温性冬油菜品种BrFLC6基因的下调幅度存在明显差异，相同处理时间下与冬性天油2号相比，强冬性陇油7号下调幅度较小，通过春化的时间较长，说明不同感温性冬油菜春化率的不同虽然不受基因序列的影响，但与该基因表达模式有关。已有研究发现藏萝卜的春化也与BrrFLC基因的表达水平有关[34]。表达模式不同，春化率不同，推断不同感温性冬油菜品种中BrFLC6的表达可能受到了其它调控因子的影响。结合我们对基因顺式作用元件的分析，预测这些因子有可能是参与基因调控植物生长发育通路中的上游调控因子，这些结果也为白菜型冬油菜的进一步研究提供了线索。

4 结论

本研究首次从白菜型冬油菜基因组中鉴定得到了10个BrFLC基因，预测8个位于细胞核，1个位于叶绿体，1个位于细胞质。生物信息学分析显示，片段复制是BrFLC扩张的主要原因，聚为一类的成员外显子、内含子、保守Motif分布相似，基因启动子区均含光应答元件，另外存在参与植物生长、激素诱导、响应低温元件。与大白菜BraFLC比对发现BrFLC6基因序列差异最大，克隆及qRT-PCR表明，白菜型冬油菜的不同感温性与BrFLC6基因序列无关，但不同感温性冬油菜通过春化与该基因表达模式有关，可能在春化处理过程中该基因的表达受到了其它调控因子的影响。该结论为进一步研究基因功能提供了参考。

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基金

甘肃省自然科学基金(20JR10RA535)
财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系(CARS-12)
省部共建干旱生境作物学国家重点实验室（甘肃农业大学）主任基金课题(GSCS-2020-Z1)
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