尖孢镰刀菌亚麻专化型FolGLS2基因功能分析

高伟娜, 侯占铭

中国油料作物学报 ›› 2024, Vol. 46 ›› Issue (2) : 294-302.

PDF(4172 KB)
欢迎访问《中国油料作物学报》， 2025年6月24日 星期二
中国油料作物学报
PDF(4172 KB)
中国油料作物学报 ›› 2024, Vol. 46 ›› Issue (2) : 294-302. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2022323
遗传育种·生物技术

尖孢镰刀菌亚麻专化型FolGLS2基因功能分析

作者信息 +

Research on the function of FolGLS2 gene in Fusarium oxysporum f. sp. lini

Author information +
文章历史 +

摘要

亚麻是我国主要的油料作物，且长期受亚麻枯萎病的侵害。β-1，3-葡聚糖合酶的催化亚基FKS/GLS为细胞壁合成所必需，本研究为鉴定尖孢镰刀菌亚麻专化型FolGLS2的功能，进行了FolGLS2基因的克隆、敲除以及敲除突变体表型和致病力的测定等试验。结果显示，FolGLS2基因全长5947 bp，cDNA开放阅读框为5847 bp，编码1948个氨基酸。表型观察发现，敲除突变体菌落小而紧实，生长速率明显降低；菌丝缩短、增粗且无法产生分生孢子；菌丝细胞壁对于常规原生质释放酶液具有抗性，无法释放原生质体；感染试验显示，突变体致病力明显减弱。上述结果表明，FolGLS2基因编码β-1，3-葡聚糖合成酶催化亚基，对菌丝营养生长、菌落形态、分生孢子发生、细胞壁组成及致病性具有调控作用。

Abstract

Flax is the main oil crop in China, and has been affected by flax wilt for a long time. The catalytic subunit of β-1, 3-glucan synthase （FKS/GLS） is necessary for cell wall synthesis, the biological function of whichwas analyzed in the study through cloningthe gene, constructing FolGLS2 gene deletion mutant, observing phenotype and assaying the virulence of the gene disruption mutants. A full-length of 5947bp DNA sequence was obtained, which contained an open reading frame 5847bp, encoding a total of 1948 amino acids. Observation of the phenotype of the FolGLS2 genedeletion mutant showed that the colony of the mutant was small and compact, its growth rate decreased obviously, the mycelium was short, thick and no longer produced conidia. The cell wall of the mutant mycelium changed somehow, which was strongly resistant to the protoplasting buffer commonly used for wild type and was unable to release protoplasts. Infection assay to the flax seedling demonstrated that pathogenicity of deletion mutant was significantly decreased. Conclusively, FolGLS2 gene, which encodes catalytic subunit of β-1, 3-glucan synthase, plays a regulatory role in conidiogenesis, mycelial vegetative growth, cell wall properties and pathogenicity of Fusarium oxysporum f.sp.lini.

关键词

尖孢镰刀菌亚麻专化型 / Split-Marker 技术 / FolGLS2 / 基因敲除

Key words

Fusarium oxysporum f.sp.lini / Split-Marker / gene disruption / FolGLS2

引用本文

EndNote

Ris (Procite)

Bibtex

导出引用
高伟娜 , 侯占铭. 尖孢镰刀菌亚麻专化型FolGLS2基因功能分析[J]. 中国油料作物学报, 2024, 46(2): 294-302 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2022323
Wei-na GAO , Zhan-ming HOU. Research on the function of FolGLS2 gene in Fusarium oxysporum f. sp. lini[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2024, 46(2): 294-302 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2022323
亚麻（Linum usitatissimum L.）又称胡麻，是一年生草本植物，为天然植物纤维主要来源。同时，亚麻油中含有大量不饱和脂肪酸，可预防多种疾病，深受人们喜爱，具有重要的经济价值。长期以来，亚麻枯萎病使亚麻生产受到极大限制[1]，该病主要由尖孢镰刀菌亚麻专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lini）引起，是导致世界范围内亚麻减产并造成严重经济损失的病害之一[2~4]。尖孢镰刀菌亚麻专化型菌株主要以孢子形式侵染亚麻，使亚麻在全生育期内均可发生系统性微管束病害，主要表现为维管束变黑，根茎变褐色并腐烂，叶片枯萎，甚至导致整个植株死亡[5]。
尖孢镰刀菌（Fusariun oxysporum）是一种土传病原性真菌并广泛分布于世界各地，具有致病力强、致病范围广等特点[6]。根据尖孢镰刀菌的寄主专一性，目前已报道100多种分化型菌株，可引起一百多种农作物感染根腐病或枯萎病，严重危害农作物的经济价值。同时，
其产生的真菌毒素可严重危害动物及人类健康[7, 8]。此外，同一专化型的菌种因致病性不同又可分为不同生理小种[9]，而不同专化型在不同寄主间也存在着交叉感染，这使得防治植物感染尖孢镰刀菌病害更加困难[10]。目前，针对于尖孢镰刀菌致病基因的研究，主要集中在古巴专化型和番茄专化型上，在亚麻专化型中的研究报道较少，因此，针对亚麻专化型的研究对于进一步防治亚麻枯萎病至关重要。
目前对于植物病原菌的研究主要集中在信号转导途径、细胞壁降解酶、细胞壁整合相关基因以及真菌毒素合成相关基因等方面[11, 12]。细胞壁是病原真菌维持形态以及抵抗环境胁迫所必需的，β-1，3-葡聚糖是真菌细胞壁的主要成份，其合成酶的催化亚基FKS/GLS在细胞极性生长中发挥重要作用，对维持细胞壁完整性及真菌形态具有重要意义[13]。FKS催化β-1，3-葡聚糖的合成是由多种因子调控完成的，其中β-1，3-葡聚糖合成酶的调节亚基Rho1起主要作用，FKS与Rho1的相互作用将β-1，3-葡聚糖合酶复合物与真菌的细胞壁完整合成途径联系起来[14]。研究发现在酿酒酵母、念珠菌等酵母样真菌中一般有3种亚型FKS，不同亚型在功能上存在着交叉，共同调控真菌的正常生长，其中FKS1的突变降低了β-1，3-葡聚糖的水平[15]。在多数丝状真菌，如构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中只有一个FKS同源基因被鉴定出来[16]。烟曲霉中，FKS蛋白定位在极化生长位点，以尿核苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glucose）为底物合成的β-1，3-葡聚糖，并将产物送入细胞壁空间中，参与完整细胞壁的组装[17]。构巢曲霉菌中发现FKSA基因的表达在菌株营养生长时期不断增加[18]。在玉米炭疽菌（C. graminicola）的研究中发现，该菌的致病性和触发的免疫逃避依赖于β-1，3-葡聚糖合酶的感染结构特异性表达 [19]。同样的在稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）中，β-1，3-葡聚糖的掩盖可使真菌细胞壁在感染植物期间免受植物细胞消化酶的消化，同时可以抑制植物细胞对于致病菌丝的识别[20]。目前关于尖孢镰刀菌的细胞壁整合相关机制研究较少，针对细胞壁整合相关基因的研究对防控病原真菌感染植株具有重要意义。
课题组前期针对细胞壁合成途径部分相关基因已进行了初步研究，尖孢镰刀菌FolGLS2基因为细胞壁整合途径下游基因，是与酵母同源的FKS基因，在禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）PH-1中被命名为FgGLS2。本研究为探究尖孢镰刀菌亚麻专化型中该基因的功能，以禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici）等四种菌为FgGLS2基因的同源引物设计菌，克隆尖孢镰刀菌亚麻专化型的FolGLS2基因后，进行生物信息学分析，并通过基因敲除方法获得FolGLS2基因敲除突变株。综合敲除菌株表型变化及致病性变化进一步确定该基因的功能，对有效应对尖孢镰刀菌亚麻专化型病原真菌感染，防治亚麻枯萎病提供更可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验使用的尖孢镰刀菌亚麻专化型野生菌株（hm）由内蒙古自治区农牧科学院提供，pCB1003质粒载体（含hph序列）来源于美国普渡大学，目前均保存于课题组。

1.2 主要试剂与仪器

试验试剂：真菌基因组提取试剂盒（Bio Flux）、胶回收试剂盒（TIANGE）、普通质粒小提试剂盒（TIANGE）、反转录试剂盒、Sangon Biotech SanPrep 柱式PCR产物纯化试剂盒（Sangon Biotech）。Yeast Extract、D-glucose、Carboxymethyl cellulose sodium、Peptone、Casein Acids Hydrolysate、Sucrose、Agarose、Agar、LMT agar、KH2PO4、Tris base、PEG8000、KH2PO4、Na2HPO4、KCl、NH4NO3、NaCl、维生素、微量元素等药品。KOD-Plus-Neo、Driselase、Chitinase、Lysing enzyme等酶。抗生素Hygromycin B、Ampicillin。YEPD、TCC、CMC、TB3、MS等培养基。

1.3 方法

1.3.1 hm 基因组DNA及RNA的提取

挑取野生菌丝hm于YEPD液体培养基中，25℃，180 r/min培养四天，双层灭菌miracloth过滤收集菌丝，吸水纸吸干菌丝上培养基水分，-80℃保存菌丝备用。取0.4 mg菌丝于液氮中研磨成粉末，并分别使用真菌基因组提取试剂盒及反转录试剂盒提取基因组DNA及总RNA。使用0.1%的琼脂糖凝胶电泳检测检测提取产物。

1.3.2 FolGLS2基因序列克隆及序列测定

通过比对亚麻专化型尖孢镰刀菌的几种近缘真菌的GLS2序列，在保守区设计引物（Fol 1F~Fol 18R），以hm基因组DNA为模板，PCR克隆FolGLS2编码区及其侧翼序列。将克隆产物送上海生物工程有限公司测序。提取hm total RNA，反转录形成cDNA，PCR克隆FolGLS2 CDS序列并测序，确定基因编码区序列。试验所需引物见表1。
表1 引物序列

Table 1 Primer sequence

引物

Primer name

序列 （5'-3'）

Primer sequence （5'-3'）
Fol 1F TTTAGGGGCGATGG
Fol 2R CGGCACTGCAAGAT
Fol 3F CTGTTGATCGCTTCTGACA
Fol 4R GTAGTAGCCGTCGTCGTTG
Fol 5F GCGCATCCACATGTGT
Fol 6R GACATCTTGTTCATGCG
Fol 7F TTGAGTTTCAGCGGTCT
Fol 8R CATCAGGGCAAGAACAAT
Fol 9F TGGCAATGTCCTATGG
Fol 10R CTTCATCAAGGTAAGCGATC
Fol 11F GAACTACAGCCGTGCCATC
Fol 12R CGAGCGCCGAAGTAAATAGC
Fol 13F CAGAACATTTCGTTCGGTG
Fol 14R CGAGCAGGCTGAGAGAT
Fol 15F GTCATTTGTATCCAACGCTTCT
Fol 16R CATATCTWACAGGGGCTCAACG
FolGLS2-1F CGCTTCTGACATCTTAATCC
FolGLS2-2R TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCC GATACTGGCAACCTTCAT
FolGLS2-3F ATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTC CATTTGTACTCACTCGGAAT
FolGLS2-4R GATCGTGCTGGACTGCTCATTC
HYG-F GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA
HY-R TTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATAC
YG-F GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT
HYG-R ATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTC
GLS2-N1F CAGAACATTTCGTTCGGTG
GLS2-N2R CACTATGAGGAGGGTGAAG

1.3.3 FolGLS2基因生物信息学分析

使用ProtParam tool （https://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白的各种理化性质；ProtScale （https://web.expasy.org/protparam/）预测蛋白的亲疏水性；DeeP TMHMM Server （https://services.healthtech.dtu.dk/service.DeepTMHMM）预测蛋白的跨膜结构域；SignalP 6.0 Server （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）预测蛋白的信号肽；WolF PSORT （https://wolfpsort.hgc.jp/）预测蛋白质亚细胞定位；Conserved Domains数据库（NCBI）分析氨基酸序列的保守结构域；NetOGlyc 1.0 Server，NetOGlyc 4.0 Server （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php）预测蛋白质糖基化位点；NetPhos3.0 Server （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）预测蛋白质磷酸化位点；SOPMA （http://pbil.ibcp.fr/）预测蛋白的二级结构；使用NCBI数据库对氨基酸序列多重比对，进一步使用Mega7构建系统进化树。

1.3.4 Split Marker 技术构建基因缺失盒

以pCB1003质粒为模板，HYG-F/HY-R、HY-F/HYG-R为引物，克隆hph上下游断裂片段。以hm基因组DNA为模板，FolGLS2-1F/ FolGLS2-2R、FolGLS2-3F/ FolGLS2-4R为引物，克隆FolGLS2基因上下游侧翼片段。分别以上述的PCR产物上下游组合作为模板，以FolGLS2-1F/HY-R和YG-F/ FolGLS2-4R为引物，Overlapping PCR扩增重叠上游与重叠下游片段[21]。使用重叠上下游片段对hm原生质体进行PEG诱导转化[22][23]。

1.3.5 FolGLS2敲除转化子的筛选与鉴定

挑取转化子于选择性培养基（hph）培养3~5 d，选择与hm菌落形态有差异的菌株作为候选株。提取其基因组DNA作为模板进行正、负筛选鉴定。其中，使用FolGLS2基因内部引物GLS2-N1F/GLS2-N2R对转化子进行PCR负筛选，使用HYG-F/HYG-R、FolGLS2-1F/HY-R、YG-F/FolGLS2-4R序列引物对转化子进行正筛选。挑选出敲除突变体∆FolGLS2和外插入突变体ecFolGLS2。

1.3.6 FolGLS2敲除突变体的表型观察及致病力分析

接种hm、∆FolGLS2和ecFolGLS2于TCC中，25℃恒温培养6 d，观察不同菌株菌落形态并记录菌落生长速率。将三种菌株于CMC（含AMP）中，180 r/min、25℃培养3 d，miracloth过滤收集分生孢子，观察分生孢子形态，并使用血球计数板对各菌株孢子产量进行统计。接种菌株于YEPD（含AMP）中，于180 r/min、25℃恒温培养4 d，观察不同菌株的菌丝形态。为了检测FolGLS2基因的缺失是否改变菌丝细胞壁成分，实验测试了菌丝体对裂解酶液（Driselase、Chitinase、Lysing enzyme）的敏感性，将YEPD中培养10 h的hm、∆FolGLS2菌丝进行过滤，分别转移少量菌丝至30 mL原生质体Buffer中，80 r/min、30℃震荡裂解，观察并记录3 h、6 h裂解时原生质体释放情况。将亚麻种子接种于MS培养基中，培养箱培养12~15 d，取等量菌液分别侵染每株亚麻幼苗根部，继续培养12~15 d，观察并记录亚麻幼苗生长状况。每种表型鉴定均做三次生物学重复试验。

2 结果与分析

2.1 FolGLS2基因序列克隆

2.1.1 野生型hm真菌基因组DNA及总RNA的提取

提取野生型hm真菌基因组DNA和总RNA，取5 μL样品进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带符合预期大小（图1A、B）。
图1 hm基因组DNA及RNA
注：A: M: DL 1000 Marker; A:1:hm 基因组DNA; B: hm total RNA

Fig. 1 hm total genomic DNA and RNA

Note: M: DL 1000 Marker; A: 1: hm total genomic DNA; B: 1, 2: hm total genomic RNA

Full size|PPT slide

2.1.2 FolGLS2基因序列及其cDNA序列确定

根据真菌GLS序列同源性比对分析，设计同源区PCR引物（表1），以hm基因组DNA及cDNA为模板进行PCR克隆。通过对PCR产物测序结果比对分析，确定FolGLS2基因全长序列为5947 bp（Gen ID:2660730），其中含有两个内含子分别为52 bp和48 bp，确定FolGLS2基因cDNA全长为5847 bp（Gen ID:2660730），编码1948个氨基酸。

2.2 FolGLS2基因生物信息学分析

该基因编码蛋白的分子量为222.3 kD，等电点为8.45，稳定系数为37.3，无信号肽，属亲水性、非分泌型蛋白，主要分布在质膜上，具有17个跨膜结构域（504-524、550-570、589-608、620-646、675-695、729-757、1356-1372、1409-1429、1499-1517、1523-1543、1615-1636、1664-1693、1703-1726、1735-1755、1790-1800、1803-1823、1861-1881）；该蛋白在356-365aa具有pfam14288保守结构域，866-1693aa具有pfam02364保守结构域，属Glucan synthase superfamily；糖基化、磷酸化位点预测结果显示，该蛋白有2个N-糖基化位点（1016、1923），37个O-糖基化位点；93个Ser磷酸化位点，56个Thr磷酸化位点，45个Try磷酸化位点；二级结构预测显示，主要为α-螺旋（40.09%），β-折叠（4.98%），无规则卷曲（40.86%）和延伸链（14.07%）。BLAST比对结果显示该氨基酸序列与F. verticillioides、F. oxysporum f. sp. Lycopersici、F. venenatum、F. pseudograminearum、F. graminearum PH-1、F. fujikuroi、F. flagelliforme、F. xylarioides、F. equiseti等真菌的GLS2氨基酸序列同源性高达90%以上。进一步构建系统发育树，发现该蛋白氨基酸序列与F. equiseti遗传距离最近（图2）。
图2 FolGLS2与其它物种GLS蛋白系统进化树分析

Fig. 2 Phylogenetic tree derived from the alignment of amino acid sequences ofFolGLS2 and other GLS

Full size|PPT slide

2.3 FolGLS2基因缺失盒的构建

Split Marker 技术构建基因敲除载体（图3A）。PCR扩增基因片段，获得hph上下游断裂片段分别为764 bp、931 bp（图3B），FolGLS2基因上下游侧翼序列分别为634 bp、681 bp（图3C）。Overlapping PCR扩增出预期大小片段分别为1398 bp、1612 bp（图3D）。
图3 FoGLS2敲除缺失盒的构建
注：M: DL 1000 Marker; A: Split-marker示意图; B: hph 上下游断裂片段PCR扩增产物 1: hph 基因上游断裂片段PCR扩增产物; 2: hph 基因上游断裂片段PCR扩增产物; C: FolGLS2上下游序列PCR扩增产物1: FolGLS2上游PCR扩增产物; 2: FolGLS2下游PCR扩增产物; D: FolGLS2 Split-Marker重叠PCR产物1: FolGLS2 1F/HY-R重叠PCR产物; 2: YG-F/ FolGLS2 4R重叠上游PCR产物

Fig. 3 Construction for deletion cassettle of FolGLS2

Note: M: DL 1000 Marker; A: Split-marker Diagram; B: PCR amplification product of upstream and downstream fragments of hph; 1: PCR product of upstream fragment of hph; 2: PCR product of downstream fragment of hph; C: PCR amplification product of upstream and downstream sequence of FolGLS2; 1: PCR amplification product of upstream sequence of FolGLS2; 2: PCR amplification product of downstream sequence of FolGLS2; D: Overlaping PCR product for FolGLS2 Split –Marker recombiniation; 1: FolGLS2 1F/HY-R Overlaping PCR product; 2: YG-F/ FolGLS2 Overlaping PCR product

Full size|PPT slide

2.4 FolGLS2基因敲除转化子的筛选鉴定

选取转化子到选择性TCC培养基上，阳性转化子可以继续生长，选择与野生型生长不同的转化子，提取转化子基因组DNA（图4A）。GLS2-N1F/GLS2-N2R引物序列位于FolGLS2基因内部，以该引物对FolGLS2基因敲除转化子进行PCR负筛查，在hm和ecFolGLS2中出现1253 bp条带，∆FolGLS2中无条带（图4B）。分别使用HYG-F/HYG-R、FolGLS2-1F/HY-R、YG-F/FolGLS2-4R序列引物对转化子进行正筛查，在∆FolGLS2和ecFolGLS2中均可获得1381 bp、1398bp、1 612bp片段，hm中无条带（图4C、D、E）。
图4 FolGLS2基因敲除突变体的筛选
注：M: DL 1000 Marker; A: ∆FolGLS2基因组DNA; 1~7: 转化子1~7基因组DNA; B: ∆FolGLS2以GLS2-N1F/GLS2-N2R 为引物PCR负筛选; 1: 野生型基因组DNA为模板PCR产物; 2~8:转化子1~7基因组DNA为模板PCR产物; C: ∆FolGLS2以HYG-F/HYG-R为引物正筛查; D: ∆FolGLS2以FolGLS2-1F/HY-R为引物正筛查; E:∆FolGLS2以YG-F/FolGLS2-4R为引物正筛查; C,D,E:1:hm基因组DNA为模板; 2~4,8: 转化子1~3,7基因组DNA为模板

Fig. 4 Screening for knockout mutant of FolGLS2

Note: M: DL 1000 Marker; A: Genomic DNA of ∆FolGLS2; 1~7: Genomic DNA oftransformants; B: Negative screening of ∆FolGLS2 by PCR using GLS2-N1F/GLS2-N2R as primer; 1: Genomic DNA of the wild type as template; 2~8: Genomic DNA of transformants as template; C: Positive screening of ∆FolGLS2 using HYG-F/HYG-R as primers; D: Positive screening of ∆FolGLS2 using FolGLS2 1F/HY-R as primers; E: Positive screening of ∆FolGLS2 using YG-F/FolGLS2 4R as primers; C,D,E: 1: Genomic DNA of the wild type as template; 2~4,8: The genomic DNA of transformants 1~3 and 7 is used as a template

Full size|PPT slide

2.5 FolGLS2基因敲除突变体的表型检测及致病力鉴定

通过PCR筛查鉴定及序列测定共挑选得到6个具有相同结果的敲除突变体，任选其中三个敲除突变体进行表型检测及致病力鉴定。结果如下：
观察TCC培养基中的菌落形态，hm与ecFolGLS2菌落生长无明显区别，均为粉色辐射状蓬松菌丝。∆FolGLS2生长明显减慢，菌落小而紧实，菌丝聚集成团，菌落颜色呈现粉白色（图5A）。连续6天对三者的菌落直径进行测量，统计分析得出，∆FolGLS2的生长速率较hm和ecFolGLS2具显著差异，生长速率明显减慢（图5B）。
图5 不同菌株表型分析
注：A: TCC培养基菌落形态; B:菌落生长速率; C: 分生孢子形态; D: 不同菌株分生孢子产量; E: 25℃菌丝形态; F: 亚麻幼苗侵染试验; G: 原生质体释放试验

Fig. 5 Phenotypic analysis experiment of different strains

Note: A: Colony morphology of wild type hm, ΔFolGLS2 and ecFolGLS2 cultured on TCC; B: The mycelium growth rate; C: Conidia morphology of hm, ΔFolGLS2 and ecFolGLS2; D: Statistical analyses on conidia number of different strains; E: Hyphal morphology of hm, ΔFolGLS2 and ecFolGLS2 in YEPD medium; F: Infection experiment of flax seedlings; G:Protoplast release of hm and ΔFolGLS2

Full size|PPT slide

观察CMC培养基中的分生孢子的产生，并利用血球计数板对分生孢子计数，发现hm与ecFolGLS2均有大量分生孢子形成，且分生孢子形态无明显差异（P>0.05），而∆FolGLS2中无分生孢子形成（图5C、5D）。
在YEPD培养基中，hm与ecFolGLS2菌丝形态无明显差异，∆FolGLS2菌丝缩短，产生囊泡状凸起，分支增多（图5E）。
在亚麻侵染试验中，hm与ecFolGLS2侵染后幼苗出现不同程度的枯黄，∆FolGLS2侵染后幼苗依然为绿色（图5F）。
酶裂解液处理3h时，hm菌丝基本破碎，释放大量原生质体，∆FolGLS2菌丝依然完整，无原生质体释放。持续处理至6h时，∆FolGLS2依然无原生质体释放（图5G）。

3 讨论

尖孢镰刀菌亚麻专化型是造成亚麻感染枯萎病最主要的真菌，目前该真菌的基因组序列未知，为了更好的研究FolGLS2基因在真菌营养生长、分生孢子形成、致病性中的相关作用，本研究克隆得到了FolGLS2基因的全长序列5947 bp，cDNA序列5847 bp。通过生物信息学分析，发现该蛋白具有pfam14288保守结构域和pfam02364保守结构域，为亲水性、非分泌型蛋白，主要分布在质膜上，所得数据足以支持后续克隆该基因编码β-1，3-葡聚糖合成酶催化亚基的假设[24]。该基因编码氨基酸序列与F. oxysporum f.sp. Lycopersici等多种真菌的GLS2氨基酸序列同源性高达90%以上，推测该氨基酸序列在系统进化中具有高度的保守性，为后续从分子角度探究该基因功能奠定基础。
β-1，3-葡聚糖合酶催化亚基在真菌的细胞壁组装和生长中起重要作用，通过构建FolGLS2突变体菌株，发现∆FolGLS2的菌丝体的菌丝缩短且顶端发生膨胀凸起，这与在Metarhizium acridum中利用FKS-RNAi得出的结果一致，同时也与一些β-1，3-葡聚糖合成酶抑制剂的作用效果相似[20, 25]，这表明FolGLS2亚基在细胞壁整合中起重要作用，有助于维持细胞壁完整性。真菌分生孢子的形成需要细胞壁物质的沉积，研究表明分生孢子的发生由cAMP-PKA途径调节[26]，敲除突变体∆FolGLS2无分生孢子形成，且在Fusarium solani f.sp. Pisi的FKS-RNAi菌株中，分生孢子生成大量减少且孢子发生破裂的现象[27]，推测该结果可能因真菌细胞壁的缺陷，而使无性生殖的调控受到影响，说明该基因与酿酒酵母中的FKS2和FKS3一样为孢子形成的必需基因[15]。敲除突变体菌丝生长出现明显的表型变化，菌落小而紧实，生长速率明显降低，推测该基因的缺失使菌丝细胞壁成分发生变化，从而改变了菌丝营养生长相关基因的表达，最终导致菌丝的生长速率减慢[28]。
在裂解酶敏感性实验中发现，敲除突变体∆FolGLS2菌丝在酶解6 h时细胞壁依然完整，无原生质体释放，表明∆FolGLS2菌丝对酶解液不敏感。推测β-1，3-葡聚糖的缺失可能被其它细胞壁成分所代替，如几丁质、甘露聚糖、α-1，3-葡聚糖等。细胞壁成分的替代弥补性变化在其他真菌中也有报道。例如，在烟曲霉中AGS基因缺失导致α-1，3葡聚糖的缺失，但AGS基因缺失突变体的细胞壁超微结构和厚度与野生菌株没有显著差异[29]。这表明，无论细胞壁中某一物质是否减少或缺失，细胞壁中各成分的比例都会有适当的调节，以便于菌丝正常形态的维持。在几种真菌中，cAMP信号转导途径被证明参与致病性[30, 31]。亚麻侵染试验中敲除突变体∆FolGLS2的致病性明显减弱，这与C. graminicola中β-1，3-葡聚糖合成缺陷的菌株的毒力明显降低一致[19]。推测FolGLS2基因的缺失使得cAMP信号通路中的某些控制致病因子的调控受到影响。结合cAMP-PKA途径调节孢子发生，再次说明FolGLS2基因对cAMP信号转导途径具有一定调控作用。
课题组前期对FolCbk1、Folprp4、FolFTL1、FolCPKR、Folpcs1等基因的研究发现，这些基因的缺失均会对菌丝营养生长、分生孢子的发生产生类似的影响，表明菌丝营养生长、分生孢子的发生以及菌株致病性均受到多条通路中多个基因的复杂调控。但不同基因缺失产生的影响具有一定的差异性，与FolGLS2基因相比，Folprp4、FolCbk1基因的缺失导致菌丝生长速率降低更加严重，Folpcs1基因的缺失虽然与FolGLS2基因的缺失一样，导致分生孢子发生彻底丧失，但Folpcs1基因缺失后菌株仍然具有较强的致病性[32]。本研究构建了FolGLS2基因敲除突变株，初步探索了该基因的功能。结果表明，FolGLS2是尖孢镰刀菌亚麻专化型菌株的β-1，3葡聚糖合成酶催化亚基。同时，FolGLS2基因对于菌丝营养生长、菌落形态、分生孢子发生以及菌株致病性具有一定调控作用。为更深入研究该基因的作用机理、防治亚麻枯萎病以及提高亚麻产量提供更可靠的理论依据。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
1
杨学. 亚麻苗期病害发生特点及防治技术研究［J］. 中国麻业， 2003， 25（5）： 223-227. DOI： 10.3969/j.issn.1671-3532.2003.05.004 .
本文引用 [1]
2
岳增良. 亚麻枯萎病病原菌鉴定及抗病品种筛选利用研究［J］. 河北农业科学， 1992（2）： 36. DOI： 10.16318/j.cnki.hbnykx.1992.02.015 .
本文引用 [1]
3
潘虹， 吴广文， 宋喜霞， 等. 亚麻枯萎病病原菌生理小种研究进展［J］. 中国麻业科学， 2011， 33（2）： 100-104. DOI： 10.3969/j.issn.1671-3532.2011.02.011 .
4
刘新月， 李凡， 陈海如， 等. 致病性尖孢镰刀菌生物防治研究进展［J］. 云南大学学报： 自然科学版， 2008， 30（S1）： 89-93.
本文引用 [1]
5
潘冬梅， 李振伟. 亚麻苗期主要病害、致病因素和综合防治技术措施［J］. 黑龙江纺织， 2005（3）： 27-28， 31.
本文引用 [1]
6
Placinta C M， D'Mello J P F， MacDonald A M C. A review of worldwide contamination of cereal grains and animal feed with Fusarium mycotoxins［J］. Animal Feed Sci Technol， 1999， 78（1/2）： 21-37. DOI： 10.1016/S0377-8401（98）00278-8 .
本文引用 [1]
7
Edel-Hermann V， Lecomte C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races［J］. Phytopathology， 2019， 109（4）： 512-530. DOI： 10.1094/PHYTO-08-18-0320-RVW .
本文引用 [1]
8
Michielse C B， Rep M. Pathogen profile update： Fusarium oxysporum ［J］. Mol Plant Pathol， 2009， 10（3）： 311-324. DOI： 10.1111/j.1364-3703.2009.00538.x .
本文引用 [1]
9
王小静， 李敏权. 甘肃中部地区亚麻枯萎病病原菌及其致病性差异研究［J］. 中国麻业科学， 2007， 29（4）： 207-211. DOI： 10.3969/j.issn.1671-3532.2007.04.009 .
本文引用 [1]
10
纪莉景. 中国不同生态地区禾谷镰刀菌种群分化及遗传多样性分析［D］. 保定： 河北农业大学， 2007.
本文引用 [1]
11
Turrà D， Segorbe D， Di Pietro A. Protein kinases in plant-pathogenic fungi： conserved regulators of infection［J］. Annu Rev Phytopathol， 2014， 52： 267-288. DOI： 10.1146/annurev-phyto-102313-050143 .
本文引用 [1]
12
Perez-Nadales E， Di Pietro A. The transmembrane protein Sho1 cooperates with the mucin Msb2 to regulate invasive growth and plant infection in Fusarium oxysporum ［J］. Mol Plant Pathol， 2015， 16（6）： 593-603. DOI： 10.1111/mpp.12217 .
本文引用 [1]
13
Valiante V， Macheleidt J， Föge M， et al. The Aspergillus fumigatus cell wall integrity signaling pathway： drug target， compensatory pathways， and virulence［J］. Front Microbiol， 2015， 6： 325. DOI： 10.3389/fmicb.2015.00325 .
本文引用 [1]
14
Xu L N， Wang M H， Tang G F， et al. The endocytic cargo adaptor complex is required for cell-wall integrity via interacting with the sensor FgWsc2B in Fusarium graminearum ［J］. Curr Genet， 2019， 65（4）： 1071-1080. DOI： 10.1007/s00294-019-00961-3 .
本文引用 [1]
15
Ishihara S， Hirata A， Nogami S， et al. Homologous subunits of 1， 3-beta-glucan synthase are important for spore wall assembly in Saccharomyces cerevisiae ［J］. Eukaryot Cell， 2007， 6（2）： 143-156. DOI： 10.1128/EC.00200-06 .
本文引用 [2]
16
Ujita M， Katsuno Y， Suzuki K， et al. Molecular cloning and sequence analysis of the β-1， 3-glucan synthase catalytic subunit gene from a medicinal fungus， Cordyceps militaris ［J］. Mycoscience， 2006， 47（2）： 98-105. DOI： 10.1007/S10267-005-0278-0 .
本文引用 [1]
17
Dichtl K， Ebel F， Dirr F， et al. Farnesol misplaces tip-localized Rho proteins and inhibits cell wall integrity signalling in Aspergillus fumigatus ［J］. Mol Microbiol， 2010， 76（5）： 1191-1204. DOI： 10.1111/j.1365-2958.2010.07170.x .
本文引用 [1]
18
Park B C， Park Y H， Yi S， et al. Transcriptional regulation of fksA， a β-1， 3-glucan synthase gene， by the APSES protein StuA during Aspergillus nidulans development［J］. J Microbiol， 2014， 52（11）： 940-947. DOI： 10.1007/s12275-014-4517-y .
本文引用 [1]
19
Oliveira-Garcia E， Deising H B. Infection structure–specific expression of β-1， 3-glucan synthase is essential for pathogenicity of Colletotrichum graminicola and evasion of β-glucan–triggered immunity in maize［J］. Plant Cell， 2013， 25（6）： 2356-2378. DOI： 10.1105/tpc.112.103499 .
本文引用 [2]
20
Yang M， Jin K， Xia Y X. MaFKS， a β-1， 3-glucan synthase， is involved in cell wall integrity， hyperosmotic pressure tolerance and conidiation in Metarhizium acridum ［J］. Curr Genet， 2011， 57（4）： 253-260. DOI： 10.1007/s00294-011-0344-4 .
本文引用 [2]
21
董慧霞， 侯占铭. 尖孢镰刀菌亚麻专化型Folprp4基因参与调控菌丝生长和分生孢子发生［J］. 中国生物工程杂志， 2022， 42（3）： 13-26. DOI： 10.13523/j.cb.2110024 .
本文引用 [1]
22
Catlett N L， Lee B N， Yoder O C， et al. Split-marker recombination for efficient targeted deletion of fungal genes［J］. Fungal Genet Rep， 2003， 50（1）： 9-11. DOI： 10.4148/1941-4765.1150 .
本文引用 [1]
23
Goswami R S. Targeted Gene Replacement in Fungi Using a Split-Marker Approach［M］// Plant Fungal Pathogens.， 2012： 255-269.10.1007/978-1-61779-501-5_16
本文引用 [1]
24
Beauvais A， Bruneau J M， Mol P C， et al. Glucan synthase complex of Aspergillus fumigatus ［J］. J Bacteriol， 2001， 183（7）： 2273-2279. DOI： 10.1128/JB.183.7.2273-2279.2001 .
本文引用 [1]
25
Caracuel Z， Martínez-Rocha A L， Di Pietro A， et al. Fusarium oxysporum gas1 encodes a putative beta-1， 3-glucanosyltransferase required for virulence on tomato plants［J］. Mol Plant Microbe Interact， 2005， 18（11）： 1140-1147. DOI： 10.1094/MPMI-18-1140 .
本文引用 [1]
26
Li C Q， Zhang Y H， Wang H， et al. The PKR regulatory subunit of protein kinase A （PKA） is involved in the regulation of growth， sexual and asexual development， and pathogenesis in Fusarium graminearum ［J］. Mol Plant Pathol， 2018， 19（4）： 909-921. DOI： 10.1111/mpp.12576 .
本文引用 [1]
27
Ha Y， Covert S F， Momany M. FsFKS1， the 1， 3-β-glucan synthase from the caspofungin-resistant fungus Fusarium solani ［J］. Eukaryotic cell， 2006， 5（7）： 1036-1042.
本文引用 [1]
28
郭雪芳， 侯占铭. 小麦赤霉菌FGSG08948基因敲除及功能研究［J］. 分子植物育种， 2018， 16（8）： 2409-2414. DOI： 10.13271/j.mpb.016.002409 .
本文引用 [1]
29
Yoshimi A， Sano M， Inaba A， et al. Functional analysis of the α-1， 3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans： AgsB is the major α-1， 3-glucan synthase in this fungus［J］. PLoS One， 2013， 8（1）： e54893. DOI： 10.1371/journal.pone.0054893 .
本文引用 [1]
30
Liebmann B， Gattung S， Jahn B， et al. cAMP signaling in Aspergillus fumigatus is involved in the regulation of the virulence gene pksP and in defense against killing by macrophages［J］. Mol Gen Genomics， 2003， 269（3）： 420-435. DOI： 10.1007/s00438-003-0852-0 .
本文引用 [1]
31
Brakhage A A， Liebmann B. Aspergillus fumigatus conidial pigment and cAMP signal transduction： significance for virulence［J］. Med Mycol， 2005， 43（sup1）： 75-82. DOI： 10.1080/13693780400028967 .
本文引用 [1]
32
郭晶， 侯占铭. Folpcs1基因对尖孢镰刀菌亚麻专化型的无性繁殖和营养生长的调控［J］. 中国生物工程杂志， 2020， 40（3）： 48-64. DOI： 10.13523/j.cb.1908059 .
本文引用 [1]

基金

国家自然科学基金(31160280)
内蒙古自治区自然科学基金(2015MS0311)
PDF(4172 KB)

663

Accesses

0

Citation

Detail
段落导航
相关文章

    联系我们

  • 地址：武汉市武昌徐东二路２号中国农业科学院油料作物研究所
  • 邮编：430062
  • 电话：027-86813823
  • 传真：027-86813823
  • E-mail：ylxb@oilcrops.cn
《中国油料作物学报》编辑部　鄂ICP备05004334号-9

/

〈 〉