花生CC-NBS-LRR家族基因鉴定及在青枯病和网斑病胁迫下的表达分析

汪晓, 齐飞艳, 孙子淇, 郑峥, 徐静, 王娟, 韩锁义, 黄冰艳, 董文召, 张新友

中国油料作物学报 ›› 2025, Vol. 47 ›› Issue (2) : 344-355.

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欢迎访问《中国油料作物学报》， 2025年6月2日 星期一
中国油料作物学报
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中国油料作物学报 ›› 2025, Vol. 47 ›› Issue (2) : 344-355. DOI: 10.19802/j.issn.1007-9084.2023321
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花生CC-NBS-LRR家族基因鉴定及在青枯病和网斑病胁迫下的表达分析

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Genome-wide identification and analysis of CC-NBS-LRR family in response to bacterial wilt and web blotch in peanut

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摘要

为明确花生基因组中CC-NBS-LRR（CNL）的家族成员及其功能，对其基因家族成员进行生物信息学分析和表达模式分析，研究花生如何响应病害胁迫。以花生基因组序列为参考，利用Pfam、HMMER、NCBI和Coiled-Coil等软件和在线网站筛选，共鉴定得到85个AhCNL家族成员，分布在20条染色体中的15条上，以A02和A12染色体上分布最多，并且大多成簇存在于染色体末端；系统进化树分析表明其可分为4个亚族，每个亚族中的基因成员保守性较高；共线性分析表明在物种内有16对基因存在共线性关系，物种间分析表明相比于拟南芥和苜蓿，花生与大豆的CNL具有较高的同源性；启动子上含有大量与激素相关和抗病相关的顺式作用元件；大部分CNL家族基因在病菌入侵前后均不表达，少部分基因受到病菌诱导后表达量有变化。

Abstract

In order to identify the CC-NBS-LRR (CNL) family members and their functions in peanut genome, tbioinformatics analysis and expression pattern of the gene family members were carried out to lay a foundation for peanut responds to disease stress. Using peanut genome sequences as reference, 85 AhCNL family members were identified using Pfam, HMMER, NCBI and Coiled Coil software and online sites. AhCNL genes are distributed on 15 out of 20 chromosomes, mainly on A02 and A12. Most of them exist in clusters at chromosomes end. Phylogenetic tree analysis showed that AhCNL genes can be divided into 4 subfamilies, and the gene members in each subfamily are highly conserved. Collinearity analysis showed that there were 16 pairs of genes in the species, and inter-species analysis showed that CNL of peanut and Glycine max had higher homology than those of Arabidopsis thaliana and Medicago sativa. The promoters of AhCNL genes contain a large number of cis-acting elements related to hormone and disease resistance. Most CNL family genes were not expressed before and after being invaded by pathogens, with a few genes changed after being induced.

关键词

花生 / CC-NBS-LRR / 青枯病 / 网斑病 / 表达分析

Key words

peanut / CC-NBS-LRR / bacterial wilt / web blotch / gene expression

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汪晓 , 齐飞艳 , 孙子淇 , 郑峥 , 徐静 , 王娟 , 韩锁义 , 黄冰艳 , 董文召 , 张新友. 花生CC-NBS-LRR家族基因鉴定及在青枯病和网斑病胁迫下的表达分析[J]. 中国油料作物学报, 2025, 47(2): 344-355 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2023321
Xiao WANG , Fei-yan QI , Zi-qi SUN , Zheng ZHENG , Jing XU , Juan WANG , Suo-yi HAN , Bing-yan HUANG , Wen-zhao DONG , Xin-you ZHANG. Genome-wide identification and analysis of CC-NBS-LRR family in response to bacterial wilt and web blotch in peanut[J]. CHINESE JOURNAL OF OIL CROP SCIENCES, 2025, 47(2): 344-355 https://doi.org/10.19802/j.issn.1007-9084.2023321
植物在与病原菌的协同进化过程中，形成了两个层次的防御系统：第一层次是病原物相关分子模式触发的免疫（pattern-triggerd immunity，PTI），第二层次是植物体内的NLR（nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat）蛋白特异或间接识别病原菌分泌的效应因子激活ETI（effector-triggered immunity）反应，R基因被激活从而触发过敏反应，引起局部细胞死亡来阻止病原菌的入侵[1,2]。NBS-LRR是植物中最大的一类家族之一，CC-NBS-LRR（coiled-coil nucleotide-binding site leucine-rich repeat，CNL）在NBS-LRR家族中发挥着重要的作用。花生是重要的经济和油料作物，受多种病原菌的侵染胁迫，严重影响花生的品质和产量。花生抵御病原菌的入侵研究比较薄弱，通过鉴定分析花生CNL基因家族，可为花生抵抗青枯病和网斑病奠定基础。
NBS-LRR类蛋白根据其N端的不同，可以分为18个种类[3]，其中最多的是TIR-NBS-LRR（toll/interleukin 1 receptor-NBS-LRR,TNL）和CNL。目前，多种植物NBS-LRR家族成员已被报道，如水稻[4]、小麦[5]、大豆[6]，紫花苜蓿[7]、向日葵[8]、烟草[9]等。在花生中，已有个别NBS-LRR被克隆：过表达花生NBS-LRR类基因AhRRS5能够增强烟草对青枯病的抗性[10]；赵小波等[11]利用同源克隆的方法，在花生中得到一个能够在干旱诱导下上调表达的NBS-LRR基因，该基因在叶片中表达量最高；AhRRLLS1属于TNL类抗性基因，能够响应脱落酸、茉莉酸、乙烯和水杨酸的诱导表达，可能在花生晚斑病菌入侵时发挥调控作用[12]；冯艳芳[13]等在花生克隆了一个NBS-LRR基因，属于CNL类抗病基因，该基因在根中特异表达，且受黄曲霉诱导后表达量上升。研究发现，CNL家族在多种植物抗病过程中发挥作用，在花生中有关CNL基因的作用少有研究，但是CNL型抗病基因在其它作物多有报道：小麦白粉病抗性基因Pm21的CC结构域能够引发细胞死亡，而其活性又受NBS和LRR结构域的负调控[14]；Pb1是水稻抗稻瘟病基因，编码CNL蛋白，可以通过其CC结构域与水杨酸信号通路中的转录因子WRKY45相互作用来抵御病菌入侵[15]；从六倍体小麦中鉴定的Lr10是一个编码CNL蛋白的叶锈病抗性基因[16]。
虽然花生NBS-LRR家族及其成员已有报道，Song等[17]将A. duranensis（AA）和A. ipaensis（BB）与栽培花生（AABB）作比较分析NBS-LRR家族的进化；张欢[3]利用花生Peant Genome Resource数据库鉴定出了NBS-LRR，并分析其对青枯菌的响应，但是尚未发现针对花生CNL家族的报道，且该家族成员在防御青枯病菌和网斑病菌方面的作用尚不明确。本文利用生物信息学的方法，在花生全基因组范围内对AhCNL家族成员进行鉴定，并研究其染色体位置、基因结构，构建物种内系统发育树，进行花生物种内与物种间的共线性分析以阐述进化过程；分析下载RNA-seq数据，分析AhCNL基因在青枯病菌和网斑病菌侵染下的表达情况，为进一步研究AhCNL家族基因的生物学功能及其对青枯病菌和网斑病菌的响应打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

所用的基因组序列、氨基酸序列及注释文件来自于花生基因组数据库PeanutBase （https://www.peanutbase.org/），植物基因组数据库Ensembl plants（http://plants.ensembl.org/index.html）。所用植物材料为花生青枯病抗性材料远杂9102和感病材料wt09-0023、花生网斑病抗性材料郑8903和感病材料PI343384。

1.2 AhCNL家族成员的获得与鉴定

NBS-LRR保守结构域NB-ARC（PF00031）和Rx-N（PF18052）从Pfam数据库（https://pfam.xfam.org/）下载。以上述下载的花生蛋白质数据为基础，利用隐马尔可夫（The Hidden Markov Model, HMM）筛选法对花生基因组数据库进行搜索，分别从结果中筛选出NB-ARC和Rx-N 的E值<1×10-19的蛋白质序列。同时通过NCBI Conserved Domians Tool 进行结构域预测，再次筛选同时包含Rx-N，NB-ARC的蛋白质序列，同时利用Coiled-Coil （https://mendel.imp.ac.at/METHODS/coil.server.html）网站分析Coiled-Coil（CC）结构域，最终得到花生基因组CNL家族基因信息库。

1.3 生物信息学分析和系统进化树构建

利用在线网站Expasy （https://web.expasy.org/protparam/）分析CNL家族蛋白的氨基酸数目、分子量和等电点。亚细胞定位的预测用在线网站WoLF PSORT （https://wolfpsort.hgc.jp/）。利用MEME[18]在线网站（https://meme-suite.org/meme/doc/meme.html）预测Motif，数量设置为15个，其余参数为默认。利用Mapgene2Chrom web v2.1在线网站（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）绘制基因在各个染色体上的位置信息，划分花生CNL基因簇的原则是2个CNL基因间的距离小于200 kb且这两个基因间的非NBS-LRR基因数不得多于8个。使用MEGAX32 对花生的CNL家族的蛋白序列进行多重比较，通过邻接法构建进化树，设置BootStrap抽样次数为1000，其余参数默认。使用EvolView[19]（https://www.evolgenius.info/evolview-v2）对进化树美化。

1.4 AhCNL家族基因启动子区顺式作用元件分析

为了分析AhCNL家族启动子中所包含的顺式作用元件分析，提取每个AhCNL起始密码子ATG上游2000 bp的序列，利用在线网站PlantCARE （http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对顺式作用元件进行预测，然后使用TBtools[20]进行作图分析。

1.5 花生CNL家族基因物种内与物种间的共线性分析

利用MCscanX[21]分析花生与拟南芥、大豆和苜蓿CNL家族成员之间的同源性，利用Circos[22]软件生成共线性分析图。

1.6 基于转录组测序数据的病害响应分析

本课题组从接种青枯病菌的青枯病抗性品种Yuanza9102（Y）和感病品种wt09-0023（W）获得转录组数据（PRJCA018886），接种网斑病病菌的网斑病抗性品种Zheng8903（ZH）和感病品种PI343384（PI）获得转录组数据（PRJNA983918）[23]。筛选出FPKM大于1的基因进行后续分析。热图用在线绘图网站微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制，参数设置：聚类方法（complete），距离方法（euclidean），回调函数（pheatmap），其余参数默认。

2 结果与分析

2.1 AhCNL家族基因的全基因组鉴定

基于已发表的栽培花生A. hypogaea var.Tifrunner v2基因组信息，利用生物信息学的方法，在花生全基因组内共鉴定到85个CNL成员，基因CDS大小介于846~4329 bp，编码氨基酸的数量在282～1442 aa，分子量大小31.93～161.76 kD，85个AhCNL蛋白的理论等电点在4.91～8.76之间。通过亚细胞定位预测发现，56个AhCNL蛋白定位于细胞核中，23个定位于细胞质中，其余6个存在于叶绿体或质膜上（表1）。
表1 花生85个CNL基因家族成员的理化特征

Table 1 Physicochemical characteristics of 85 CNL gene family members in peanut

基因编号

Gene ID

染色体位置

Genomic location

氨基酸数量/外显子个数

Number of amino acid/ Number of Exon

分子量/等电点

Molecular weight （/kD）/pI

亚细胞定位预测

Prediction of subcellular location
Arahy.JACZ02.4 Chr01：3312050-3315702 987/3 113.37/8.03 细胞核 Nucleus
Arahy.43UGZW.1 Chr01：11301625-11312545 1442/5 160.93/8.16 细胞核 Nucleus
Arahy.V7RGM7.1 Chr02：4078566-4082522 796/2 92.48/7.26 细胞质 Cytoplasm
Arahy.SL8FFE.1 Chr02：4101711-4105470 835/2 96.83/5.82 细胞核 Nucleus
Arahy.U433IA.1 Chr02：4124608-4127690 809/2 93.54/6.85 细胞质 Cytoplasm
Arahy.HEBF57.1 Chr02：4163988-4170072 727/5 84.52/7.59 质膜 Plasma membrane
Arahy.4ZR0FI.1 Chr02：96308374-96313661 1067/3 122.76/5.7 细胞核 Nucleus
Arahy.CA7JWP.1 Chr02：96358272-96363547 1025/3 117.52/5.43 细胞核 Nucleus
Arahy.VEK22B.1 Chr02：98811655-98818867 1150/5 131.51/6.1 细胞核 Nucleus
Arahy.JDC98L.1 Chr02：98819404-98823371 1056/2 120.80/6.08 细胞核 Nucleus
Arahy.EFNA3N.1 Chr02：99232985-99237258 1046/3 119.335.84 细胞核 Nucleus
Arahy.HZ3BCY.1 Chr02：99241683-99243651 638/3 73.26/6.11 叶绿体 Chloroplast
Arahy.04X3C9.1 Chr02：99256329-99261797 1066/5 121.89/5.98 细胞核 Nucleus
Arahy.DN6KXW.1 Chr02：99270487-99275094 1063/3 121.79/5.87 细胞核 Nucleus
Arahy.NJ02RL.1 Chr02：99294945-99312032 1410/4 161.76/5.83 细胞核 Nucleus
Arahy.DEFX9H.1 Chr02：99313229-99323033 1166/9 132.76/5.96 细胞核 Nucleus
Arahy.D0611N.2 Chr03：139452070-139455555 919/2 105.48/5.93 细胞核 Nucleus
Arahy.9W4GU5.1 Chr04：124649149-124654438 925/5 106.97/4.91 细胞核 Nucleus
Arahy.6QC6B5.1 Chr05：1874642-1877452 936/1 107.69/8.03 细胞核 Nucleus
Arahy.2JZ6N1.1 Chr05：1878756-1881587 943/1 108.58/8.76 细胞质 Cytoplasm
Arahy.5F1M32.1 Chr05：1982228-1987653 1178/3 133.55/7.16 细胞核 Nucleus
Arahy.A2XUUV.1 Chr05：2095653-2101711 1210/6 137.95/6.61 细胞核 Nucleus
Arahy.5YD3B8.1 Chr05：2125601-2129124 1136/2 129.60/6.45 细胞核 Nucleus
Arahy.QIQ4VJ.1 Chr05：2163726-2176862 1178/8 134.31/6.35 细胞核 Nucleus
Arahy.00IH7J.1 Chr05：2196458-2201326 1148/2 130.38/6.15 细胞核 Nucleus
Arahy.LD8LM0.1 Chr05：2226607-2231482 1133/3 129.51/6.82 细胞核 Nucleus
Arahy.SH571D.1 Chr05：2253649-2257863 1133/2 129.35/6.24 细胞核 Nucleus
Arahy.UK8PK2.1 Chr05：2290338-2297633 1210/6 137.18/8.02 细胞核 Nucleus
Arahy.0E6JXZ.1 Chr05：11424241-11427030 929/1 107.18/8.11 质膜 Plasma membrane
Arahy.49I9B6.1 Chr06：11677904-11680477 857/1 98.23/7.1 细胞质 Cytoplasm
Arahy.WRA2D9.1 Chr06：11740557-11743139 860/1 98.36/6.37 细胞质 Cytoplasm
Arahy.SF2K3E.1 Chr06：11752987-11757921 863/2 98.36/8.45 细胞核 Nucleus
Arahy.U4QDWS.1 Chr09：2395155-2398148 997/1 113.30/5.64 细胞核 Nucleus
Arahy.SY9UAE.1 Chr09：2416517-2419759 1025/2 116.32/5.88 细胞核 Nucleus
Arahy.JAA9B4.1 Chr09：2468040-2471593 1034/3 118.17/7.65 细胞核 Nucleus
Arahy.61LYXS.1 Chr09：2477993-2481178 1061/1 120.48/6.78 细胞核 Nucleus
Arahy.LWFC3J.1 Chr09：2486181-2489135 984/2 112.33/6.98 细胞核 Nucleus
Arahy.CD0F2D.1 Chr09：2491548-2495602 1023/3 116.56/6.74 细胞核 Nucleus
Arahy.JK0RBR.1 Chr09：2518481-2523581 1248/4 141.51/7.12 细胞核 Nucleus
Arahy.B2M8AQ.1 Chr10：108645497-108649206 1205/3 135.89/6.33 细胞核 Nucleus
Arahy.8IB5J3.1 Chr10：116792342-116796591 1161/5 131.79/6.86 叶绿体 Chloroplast
Arahy.N1CS9Q.4 Chr11：9806379-9809905 964/1 110.77/8.68 细胞核 Nucleus
Arahy.V6I7WA.1 Chr12：4187131-4190737 806/2 93.61/6.39 细胞质 Cytoplasm
Arahy.0EHV1A.1 Chr12：4231257-4235123 1168/3 135.59/7.29 细胞质 Cytoplasm
Arahy.P88NCS.1 Chr12：4274774-4278025 813/2 93.48/6.39 细胞质 Cytoplasm
Arahy.HZH8EM.1 Chr12：4290150-4294716 894/5 103.37/6.09 细胞质 Cytoplasm
Arahy.5D95TJ.1 Chr12：4303358-4307221 1167/3 135.50/7.12 细胞质 Cytoplasm
Arahy.WQJN9J.1 Chr12：4345900-4349148 813/2 93.48/6.39 细胞质 Cytoplasm
Arahy.LURW66.1 Chr12：4361277-4365843 894/4 103.37/6.09 细胞质 Cytoplasm
Arahy.MXY2PU.1 Chr12：4374482-4377655 807/2 93.31/6.84 细胞质 Cytoplasm
Arahy.VJM3FC.1 Chr12：115666217-115671751 1106/4 125.29/5.78 细胞核 Nucleus
Arahy.DNSK86.1 Chr12：115743002-115748315 1122/6 128.11/5.56 细胞核 Nucleus
Arahy.69MG1M.1 Chr12：115754066-115757920 1058/3 121.16/5.59 细胞核 Nucleus
Arahy.C72SYV.1 Chr12：115761554-115766435 1029/4 117.94/5.6 细胞核 Nucleus
Arahy.VH72SV.1 Chr12：115780691-115784780 1028/2 117.26/5.9 细胞核 Nucleus
Arahy.SV36IN.1 Chr12：115788741-115792932 1026/2 117.78/5.74 细胞核 Nucleus
Arahy.YSI06R.1 Chr12：115808315-115814766 1132/5 128.75/5.73 细胞核 Nucleus
Arahy.NWM239.1 Chr12：116207684-116212159 1063/3 122.14/5.85 细胞核 Nucleus
Arahy.A52RDS.1 Chr12：116281898-116287714 1260/6 144.48/6.17 叶绿体 Chloroplast
Arahy.LHRI3Q.2 Chr13：141518423-141521776 919/2 105.61/5.88 细胞质 Cytoplasm
Arahy.G31ARB.1 Chr14：8959391-8960275 291/2 31.93/5.33 叶绿体 Cchloroplast
Arahy.FZWY62.1 Chr14：138957700-138975564 925/13 106.93/8.54 细胞核 Nucleus
Arahy.GU9D1B.1 Chr15：1874642-1877452 936/1 107.69/8.03 细胞核 Nucleus
Arahy.K1RG44.1 Chr15：1878756-1881587 943/1 108.58/8.76 细胞质 Cytoplasm
Arahy.9D2PT6.1 Chr15：1982228-1987653 1178/3 133.55/7.16 细胞核 Nucleus
Arahy.23IZS7.1 Chr15：2095653-2101711 1210/6 137.95/6.61 细胞核 Nucleus
Arahy.B76PF9.1 Chr15：2125601-2129124 1136/2 129.60/6.45 细胞核 Nucleus
Arahy.GB2WAI.1 Chr15：2163726-2176862 1178/7 134.31/6.35 细胞核 Nucleus
Arahy.ES8K63.1 Chr15：2196458-2201326 1148/2 130.38/6.15 细胞核 Nucleus
Arahy.BAA5S9.1 Chr15：2226607-2231482 1133/2 129.51/6.82 细胞核 Nucleus
Arahy.U7BT81.1 Chr15：2253649-2257863 1133/3 129.35/6.24 细胞核 Nucleus
Arahy.P6QIT2.1 Chr15：2290338-2297633 1210/6 137.18/8.02 细胞核 Nucleus
Arahy.K8IZY8.1 Chr16：7861418-7864003 861/1 98.45/6.28 细胞质 Cytoplasm
Arahy.LS5HQA.1 Chr16：7864138-7868409 927/4 106.48/6.35 细胞质 Cytoplasm
Arahy.BQ15Q3.1 Chr16：7873500-7876293 892/2 102.55/7.34 细胞核 Nucleus
Arahy.YW1YRK.1 Chr16：7914179-7916761 860/1 98.46/6.47 细胞质 Cytoplasm
Arahy.8YM3XA.1 Chr16：7970226-7972814 862/1 98.55/8.67 细胞质 Cytoplasm
Arahy.19HZ0U.1 Chr16：7976956-7981056 1061/2 120.28/7.75 细胞质 Cytoplasm
Arahy.DT9DNF.1 Chr16：7989196-7991777 821/2 93.87/6.93 细胞质 Cytoplasm
Arahy.4918BH.1 Chr16：8004434-8007022 862/1 99.16/7.31 细胞质 Cytoplasm
Arahy.EM6AHT.1 Chr19：3784536-3787774 1025/2 116.11/6.22 细胞核 Nucleus
Arahy.C354H7.1 Chr19：3905470-3907367 604/3 69.08/5.96 细胞核 Nucleus
Arahy.0R3YGY.1 Chr19：4301289-4304336 1015/1 115.36/6.49 细胞核 Nucleus
Arahy.F01FM8.1 Chr20：134042163-134045891 1242/1 140.04/6.3 细胞核 Nucleus
Arahy.J3J419.1 Chr20：143617503-143623826 1280/5 145.68/8.73 细胞质 Cytoplasm

2.2 AhCNL家族基因染色体定位

根据花生85个CNL家族基因的定位分析，绘制CNL家族基因在花生染色体上的分布图（图1）。在花生20条染色体中，CNL家族基因在15条染色体上有分布，以12号和2号染色体分布最多，分别为17个和14个；以3，4和11号染色体最少，仅有1个。CNL家族基因在染色体上大多成簇存在，2号染色体上的基因簇数目最多，有4个；12号染色体2个基因簇中包含的基因数量最多。几乎所有CNL家族基因都位于染色体末端。
图1 花生AhCNL家族基因在染色体上的分布
注：红色和蓝色标注的相邻基因为基因簇，蓝色标注的基因是区分上下两个基因簇

Fig. 1 Distribution ofAhCNL gene family on peanut chromosomes

Note: The adjacent genes marked in red and blue are gene clusters, and the genes marked in blue distinguish the upper and lower gene clusters

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2.3 AhCNL家族基因结构和聚类分析

AhCNL家族基因的外显子数目各有不同，为1-13个不等，其中27个基因含有2个外显子，17个基因含有3个外显子，16个基因含有1个外显子（图2A）。85个家族成员中，有50个家族成员含有10~14个motif，有3个成员含有5～9个motif（图2B）。
图2 AhCNL家族成员保守基序motif（A)及基因的结构（B)
注：A:花生CNL基因家族成员的保守基序motif预测；B：花生CNL基因家族成员基因结构预测

Fig. 2 Conserved motif and gene structure of AhCNL gene family members

Note: A: Prediction of conserved motif of peanut CNL gene family members; B: Gene structure prediction of peanut CNL gene family members

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使用MEGA X32和在线网站EvolView对AhCNL家族蛋白序列进行系统进化树构建，根据蛋白特征可分为4个亚组，即group Ⅰ ～ group Ⅳ（图3）。最大的亚组是group Ⅱ，有27个成员，最小的亚组是group Ⅰ，有9个成员。其中group Ⅰ 的结构域包含C2、C3和C4，都含有Rx-CC-like结构域；group Ⅱ的27个成员中有21个的结构域是C14（Rx-N-NB-PLN03210），共同点是都没有LRR结构域；group Ⅲ 的结构域含有10个类型，最多的是C7和C14，各含有4个；group Ⅳ的结构域主要是C10，C14和C17，共同点是都含有PLN03210结构域（表2）。
图3 AhCNL家族蛋白的系统发育分析

Fig. 3 Phylogenetic relationships of CNL family protein in peanut

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2.4 AhCNL家族基因启动子种顺式作用元件分析

从20种不同类型结构域（表2）的AhCNL基因随机各挑选一个基因，共计对20个AhCNL基因启动子的顺式作用元件分析。利用PlantCARE对AhCNL家族中20个基因ATG上游2000 bp的顺式作用元件进行预测和分析。除去一些生长发育相关的必需元件外，AhCNL基因的启动子中包含有W-box、TC-repeats、ERE和as-1参与抗病响应的顺式作用元件以及多种植物激素相关的响应元件（图4）。W-box主要存在于抗病虫害等基因的启动子中，存在于13个AhCNL基因启动子中，有4个基因的启动子中包含多个W-box元件。15个AhCNL基因启动子包含ERE，其能够调控真菌诱导表达。TC-repeats和as-1各存在于11个AhCNL基因启动子中。20个AhCNL基因启动子均至少包含两种以上（含两种）与激素相关的元件，其中与MeJA、水杨酸、生长素、脱落酸及赤霉素相关的元件分别存在于11个、9个、6个、15个和10个AhCNL基因启动子中。
图4 花生中20个CNL家族基因的顺式作用元件分析

Fig. 4 Analysis of cis-elements in 20 of CNL family genes in peanut

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表2 AhCNL蛋白编码基因的数量及分类

Table 2 Number and classification of genes encoding CNL proteins in peanut

编号

Number

结构域预测

Prediction domain

结构域简称

Domain abbreviation

基因数量

No. of genes
C1 （RX-CC_like）-NB CN 4
C2 （RX-CC_like）-NB-LRR CNL 6
C3 （RX-CC_like）-NB-PLN00113 CN-113 1
C4 （RX-CC_like）-NB-PLN03210 CN-210 2
C5 （RX-N）-（RX-N）-NB-LRR-PLN03210 CXNL-210 1
C6 （RX-N）-NB CXN 1
C7 （RX-N）-NB-LRR CXNL 4
C8 （RX-N）-NB-LRR-LRR-PLN03210 CXNLL-210 1
C9 （RX-N）-NB-LRR-PLN00113 CXNL-113 1
C10 （RX-N）-NB-LRR-PLN03210 CXNL-210 14
C11 （RX-N）-NB-LRR-PLN03210-PLN03210 CXNL-210-210 1
C12 （RX-N）-NB-PLN00113 CXN-113 3
C13 （RX-N）-NB-PLN02503-PLN00113 CXN-203-113 1
C14 （RX-N）-NB-PLN03210 CXN-210 31
C15 （RX-N）-NB-PLN03210-DUF247 CXN-210-247 1
C16 （RX-N）-NB-PLN03210-PLN00113 CXN-210-113 1
C17 （RX-N）-NB-PLN03210-PLN03210 CXN-210-210 9
C18 （RX-N）-NB-PLN03210-PLN03210-PLN00113 CXN-210-210-113 1
C19 （RX-N）-NB-PLN03210-PPP1R42 CXN-210-R42 1
C20 LbetaH-（RX-N）-NB-PLN03210 Lb-CXN-210 1

2.5 花生、拟南芥、大豆和苜蓿CNL家族基因共线性分析

为了进一步研究花生CNL家族的进化关系，对其分别进行物种内（图5A）和物种间（图5B）的共线性分析。花生种内的共线性如图5A所示，在85个AhCNL基因中有16对基因存在共线性关系，都存在于同源染色体上。
图5 AhCNL基因家族物种内和物种间的共线性分析
注：A:花生CNL基因家族的物种内共线性关系，同一条有颜色的亮线上的花生CNL基因是线性关系；B：花生CNL基因家族分别与拟南芥、大豆和苜蓿CNL基因家族的物种间共线性关系，同一条红色线上的基因是线性关系

Fig. 5 Synteny analysis within and between species of peanut CNL gene family

Note: A: The intra-species collinear relationship of peanut CNL family, peanut CNL gene on the same colored line is linear; B: Peanut CNL family has collinear relationship with Arabidopsis thaliana, Glycine max and Medicago sativa CNL family respectively, and gene on the same red line is linear relationship

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将花生与拟南芥、大豆和苜蓿的CNL基因进行共线性分析发现，花生与大豆CNL基因存在共线性的基因数最多，共有8个，而与拟南芥和苜蓿分别只有2个和1个基因存在共线性关系（图5B）。

2.6 AhCNL家族基因在青枯病菌和网斑病菌处理下的表达分析

利用从NCBI和NDGC数据库下载的RNA-seq数据，分析花生苗期在青枯病菌以及网斑病菌处理后基因表达量的变化。在85个AhCNL基因中，大部分基因在受到青枯病菌和网斑病菌诱导前后均不表达。
青枯病抗性品种Y和感病品种W在接种青枯菌后0、12、24、48和72h的表达情况如图6A，只有16个基因在受到青枯病菌入侵前后表达量有变化。在抗性品种中， Arahy.C354H7.1、Arahy.BAA5S9.1和Arahy.JK0RBR.1在受到诱导后表达量不断增高；Arahy.19HZ0U.1、Arahy.FZWY62.1、Arahy.EFNA3N.1、Arahy.9W4GU5.1、Arahy.LS5HQA.1、 Arahy.J3J419.1和Arahy.JK0RBR.1在受到诱导后表达量先降低后增高；其余6个基因在抗性品种中表达量很低。在感病品种中，Arahy.C354H7.1、Arahy.SY9UAE.1、Arahy.HZH8EM.1和Arahy.LURW66.1在受到青枯病菌侵染后表达量不断升高；Arahy.2JZ6N1.1、Arahy.9W4GU5.1、Arahy.LS5HQA.1、Arahy.JK0RBR.1在受到诱导后12 h表达量降低，而后表达量升高。
图6 在青枯病菌（A）和网斑病菌（图B）处理下有表达的AhCNL基因家族表达热图

Fig. 6 Expression heat maps of peanut CNL gene family expressed in bacterial wilt (A) and web blotch (B)

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网斑病抗性品种ZH和感病品种PI在接种网斑病菌后0、12、24、48和60 h的表达情况如图6B，共有11个基因在受到病菌诱导后表达量有变化。在抗性材料中，Arahy.DT9DNF、Arahy.9W4GU5、Arahy.EFNA3N、Arahy.FZWY62、Arahy.J3J419和Arahy.JACZ02在受到诱导后12 h表达量上升后下降，到60 h表达量再次上升。在感病品种中，Arahy.DT9DNF和Arahy.U4QDWS、Arahy.9W4GU5、Arahy.FZWY62和Arahy.JACZ02在受到诱导12 h后表达量上升；Arahy.A52RDS、Arahy.8IB5J3、Arahy.J3J419和Arahy.NWM239在受到诱导后表达量下降。

3 讨论与结论

3.1 AhCNL家族成员的结构分析

CNL作为NBS-LRR家族最大的亚家族之一，可以识别病原体的存在。不同豆科植物含有的CNL基因数量差别较大，大豆732个，花生273个，鹰嘴豆516个，蒺藜苜蓿1064个，绿豆392个[24]。张欢[3]利用植物抗病基因数据库（PRGdb;http://prgdb.org/）鉴定花生CNL家族包含有182个，与本研究所用方法不同，鉴定的CNL个数不一样。为了确保筛选出的CNL家族的可靠性，本研究设定的阈值标准并未包含花生所有的CNL基因，数据具有局限性和不完整性，今后可进一步根据其它植物CNL家族的报道扩大范围，完善数据的完整性。
本研究中通过生物信息学分析，发现花生中CC型NBS-LRR家族包含85个CNL基因，分布花生20条染色体中的15条染色体上。物种内共线性分析表明，85个CNL基因有72个基因都呈基因簇的形式存在，以A02和A12染色体上的CNL基因最多，前人报道花生青枯病抗性QTL位于A12染色体上[25,26]。大多数AhCNL的motif有10～14个不等，这些motif表现出相似的分布模式（图2）。将花生与拟南芥、大豆和紫花苜蓿CNL类基因家族进化关系进行分析，表明花生和大豆的CNL基因同源性较高，因此花生和大豆的CNL家族在生物学功能上可能存在相似性（图5）。
对花生CNL家族系统进化分析发现（图3），Rx-CC结构域（只分布在group Ⅰ）与Rx-N结构域分布在不同的分支上，并72个基因的N端都是Rx-N，说明它们在进化上存在一定的差异；根据N端有无LRR，又将CNL分为不同的亚家族，其中group Ⅱ 中都没有LRR结构域，而group Ⅲ 和group Ⅳ的N端包含着多种类型结构域，说明C14类型的CNL比较保守，且受CC、NBS和LRR结构域的影响较大。85个AhCNL家族基因中有62个都包含有PLN03210结构域，8个有PLN00113结构域，都存在于LRR的位置；然而有PLN00113结构域的CNL没有分布在同一个分支内，随机散布在其它分支中，说明其替代LRR具有随机性，与前人分析的甜菜[27]和乌拉尔图小麦[28]一致。

3.2 AhCNL家族成员可能参与花生抵御青枯病菌和网斑病菌的过程

与植物抗病相关基因的启动子上包含有许多抗病相关的顺式作用响应元件，能够与转录因子结合进而增强抗病基因的表达来提高抗病性。在AhCNL家族基因的启动子上包含有许多激素响应元件。在受到病原菌侵袭时，植物激素的作用不可或缺。水杨酸作为植物的内源性信号分子，在受到病原菌侵害时发生过敏反应以及形成系统获得性抗性时发挥重要作用[29, 30]；茉莉酸甲酯能够在植物受到逆境时传递信号，诱导植物防御基因的表达[31]；乙烯是植物生长调节剂，可以影响多个植物生长发育过程，同时其也参与了对外界胁迫的反应，很多涉及上述相关过程的基因序列上都有乙烯响应元件[32, 33]。通过对AhCNL家族的顺式作用元件分析发现，该家族中不仅含有多种激素响应元件，还包含有防御和应激反应、低温响应元件等，说明其不但与植物生长发育有关，还参与免疫应激反应调节，这与上述报道是相符的。
Qi[25]和Wang[26]利用抗青枯病材料远杂9102但不同的RIL遗传群体建立的高密度遗传图谱，将主效青枯病抗性QTL定位在A12染色体上，虽然区间不同，但是区间内所包含的基因大多都是NBS-LRR，进一步分析CNL基因在染色体上的分布也说明在第12号染色体上有最多的CNL基因（图1）。在本课题研究的已定位的青枯病抗性区间内[25]，有11个基因都属于CNL家族，其中Chr12:4274774-4307221和Chr12:4345900-4377655两段基因序列相似度达99.9%，即Arahy.P88NCS、Arahy.HZH8EM和Arahy.5D95TJ与Arahy.WQJN9J、Arahy.LURW66和Arahy.MXY2PU在基因组上是重复的，去除重复的基因后，该区间内还有8个CNL基因；进一步分析这8个基因接种青枯菌表达趋势发现，只有Arahy.HZH8EM.1（Arahy.LURW66.1）有表达，但其在抗病材料中几乎不表达，在感病材料受青枯菌诱导表达（图6A）；所以，Arahy.HZH8EM.1可能不是青枯病抗性基因，抗性基因的挖掘还需进一步研究。目前尚未报道AhCNL家族在花生防御网斑病菌中的作用，部分基因能受网斑病菌诱导表达，具体功能还需进一步验证。
在本研究中，共鉴定了85个花生CNL基因，分布在15条染色上，大多都成簇存在；CNL家族按照其结构域的不同又可分为四个不同的分支，每个进化分支上的CNL的保守域和motif具有相似性，说明其功能也可能相似；启动子顺式作用元件分析表明AhCNL基因家族可能参与了植物激素和抗病相关过程；物种内和物种间的共线性分析表明了花生CNL基因的同源性关系，更好地理解进化机制。本研究全面分析鉴定了花生CNL基因，以期更好地理解CNL基因的生物学功能，为花生抗病遗传育种奠定一定的基础。

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